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    • 专利摘要:
    在一個態樣中，本發明提供免疫特異性結合至PSGL-1之抗體，包含編碼此等抗體之核苷酸序列的多核苷酸，及用於產生此等抗體之表現載體與宿主細胞。本發明亦提供包含特異性結合至PSGL-1之抗體的套組及醫藥組成物，以及使用本發明所述之抗體治療由活化T細胞之增殖增強及/或大量活化T細胞所引起之病症或疾病或與活化T細胞之增殖增強及/或大量活化T細胞相關之病症或疾病的方法。
    公开号:TW201302791A
    申请号:TW101121146
    申请日:2012-06-13
    公开日:2013-01-16
    发明作者:Stefan Bassarab；Barbara Enenkel；Patrick Garidel；Heidrun Schott；Sanjaya Singh；Tobias Litzenburger
    申请人:Abgenomics Cooperatief Ua；
    IPC主号:C07K16-00
    专利说明:
    抗PSGL-1抗體及其之應用
    本申請案主張2011年6月13日申請之名稱為「抗PSGL-1抗體及其之應用」之美國臨時專利申請案61/496,249為優先權。所提及之臨時申請案之全部教示及內容以引用之方式併入本文中。
    本發明提供特異性結合至P選擇素醣蛋白配位體-1(PSGL-1)的抗體、編碼此等抗體之多核苷酸、包含此等多核苷酸之表現載體、包含此等表現載體之宿主細胞及相關組成物。本發明亦提供使用抗PSGL-1抗體治療由活化T細胞之增殖增強及/或大量活化T細胞引起或與活化T細胞之增殖增強及/或大量活化T細胞相關之病症或病症(諸如牛皮癬)的方法。
    感染或創傷之發炎反應為白血球黏著至血管壁引發(McEver等人，1997,J.Clin.Invest.,100(3)：485-492)。選擇素代表在發炎期間調解最初白血球-內皮細胞相互作用及白血球-血小板相互作用之醣蛋白家族。由L選擇素、E選擇素及P選擇素組成之選擇素家族包含胺基端植物凝集素區域、隨後之似上皮細胞生長因子區域、一系列共同重複序列、跨膜區域及短細胞質尾。選擇素之植物凝集素區域與特異性複合醣體配位體相互作用以便促進細胞黏著。表現於大部分白血球上之L選擇素結合至一些內皮細胞及其他白血球上之配位體。表現於細胞介素活化之內皮細胞上之E選擇素結合至大部分白血球上之配位體。表現於活化之血小板及內皮細胞上之P選擇素亦結合至大部分白血球上之配位體。
    P選擇素醣蛋白配位體-1(「PSGL-1」)(亦稱為SELPLG或CD162(分化簇162))為所有三種選擇素之人類黏蛋白型醣蛋白配位體(Constantin,Gabriela,2004,Drugs News Perspect,17(9)：579-585；McEver等人，1997,J.Clin.Invest.,100(3)：485-492)。PSGL-1為具有兩個120-kD次單元之經雙硫鍵鍵結的同質二聚體且表現於單核球、淋巴球、顆粒球的表面及一些CD34+幹細胞中。由於PSGL-1促進選擇素之黏著性相互作用，因此在許多發炎性病症中，PSGL-1可能會引起病理性白血球添補作用，此表明PSGL-1之抑製劑(諸如PSGL-1之抗體)為潛在有用之消炎藥物。
    已開發出多種抗PSGL-1抗體(參見例如2005年11月24日公開之國際申請公開案第WO 2005/110475號、2003年2月20日公開之國際申請公開案第WO 2003/013603號；及Constantin,Gabriela,2004,Drugs News Perspect,17(9)：579-585)。
    在一個態樣中，本發明提供特異性結合至PSGL-1之抗體及抗體衍生之抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供一種免疫特異性結合至人類PSGL-1之單株抗體，該單株抗體包含：(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：3之輕鏈可變(「VL」)區；(ii)包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：4之重鏈可變(「VH」)區的重鏈；及(iii)人類IgG4恆定區，該人類IgG4恆定區在根據EU(γ-G1免疫球蛋白)索引編號之重鏈之胺基酸228處含有絲胺酸變成脯胺酸的取代(參見Edelman等人，1969,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,63(1)：78-85)。在一特定實施例中，本發明提供一種免疫特異性結合至人類PSGL-1之單株抗體，該單株抗體包含：(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：1之輕鏈；及(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：2之重鏈。在另一特定實施例中，本發明提供一種免疫特異性結合至人類PSGL-1之單株抗體，該單株抗體包含：(i)由SEQ ID NO：2組成之重鏈；及(ii)由SEQ ID NO：1組成之輕鏈。在另一特定實施例中，本發明提供一種免疫特異性結合至人類PSGL-1之單株抗體，該單株抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：2之重鏈及互補輕鏈。在一特定實施例中，純化前述任一種單株抗體。
    在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含前述任一種單株抗體及醫藥學上可接受之載劑。在一特定實施例中，該醫藥組成物包含純化之單株抗體。
    在一個實施例中，本發明提供包含前述任一種單株抗體於水溶液中的醫藥製劑，該水溶液包含檸檬酸鈉、氯化鈉及單水合檸檬酸。在一特定實施例中，醫藥製劑為包含9.1 mM之二水合檸檬酸鈉、150 mM氯化鈉及0.9 mM檸檬酸之水溶液。在另一特定實施例中，單株抗體存在於醫藥製劑中之濃度為0.267 mM。在一特定實施例中，醫藥製劑為包含2.676 g/L鈉、8.766 g/L氯化鈉、0.2 g/L聚山梨醇酯80及0.189 g/L檸檬酸之水溶液。在另一特定實施例中，單株抗體存在於醫藥製劑中之濃度為40 g/L。在一特定實施例中，所有前述水溶液pH值為6.0。
    在另一態樣中，本發明提供編碼本發明所述抗體或該抗體之抗原結合片段的多核苷酸。在一特定實施例中，本發明提供一種編碼包含SEQ ID NO：2之抗體重鏈之經分離多核苷酸。在一實施例中，表現載體包含前述經分離多核苷酸。在某些實施例中，表現載體進一步包含編碼含有SEQ ID NO：1之抗體輕鏈之多核苷酸。在一特定實施例中，表現載體為哺乳動物表現載體。在另一態樣中，本發明提供一種包含前述表現載體之宿主細胞。在一特定實施例中，該宿主細胞包含：(a)編碼SEQ ID NO：2之第一核酸，該第一核酸可操作地聯結於在該宿主細胞中具有功能之啟動子；及(b)編碼SEQ ID NO：1之第二核酸，該第二核酸可操作地聯結於在該宿主細胞中具有功能之啟動子。在另一特定實施例中，宿主細胞之第一核酸及第二核酸皆位於相同表現載體中或位於不同表現載體中。
    在另一態樣中，本發明提供一種產生前述任一種單株抗體之方法，該方法包含以下步驟：培養前述任一種宿主細胞，以使得該細胞表現該第一核酸及該第二核酸，且該重鏈與該輕鏈組裝在一起而形成該抗體。
    在另一態樣中，本發明提供一種包含SEQ ID NO：2之抗體重鏈或包含SEQ ID NO：2之胺基酸1至228之抗體重鏈片段。在一特定實施例中，本發明提供一種包含SEQ ID NO：2之抗體重鏈。在另一特定實施例中，本發明提供一種包含SEQ ID NO：2之胺基酸1至228之抗體重鏈片段。本發明亦提供一種產生前述重鏈之方法，該方法包含以下步驟：培養前述任一種宿主細胞以使得該細胞表現該重鏈，及分離該重鏈。在一特定實施例中，一種產生前述任一種抗體之方法包含以下步驟：根據產生重鏈之前述方法產生重鏈，分離該重鏈，及使該重鏈與包含SEQ ID NO：1之抗體輕鏈複合。
    在另一態樣中，本發明提供一種包含第一容器之套組，該第一容器含有前述任一種單株抗體。在一特定實施例中，該第一容器為小瓶，該小瓶含有在真空下為凍乾無菌粉末之該單株抗體，且該套組進一步包含第二容器，該第二容器包含醫藥學上可接受之流體。本發明亦提供一種含有前述任一種單株抗體之注射裝置。在一特定實施例中，該注射裝置為注射器。
    在另一態樣中，本發明提供預防及/或治療與活化T細胞增加及/或大量活化T細胞相關或(完全或部分)由活化T細胞增加及/或大量活化T細胞引起之疾病或病症的方法，活化T細胞增加及/或大量活化T細胞係相對於健康個體或未患有該特定疾病或病症之個體而言。在一特定實施例中，本發明提供一種治療發炎性病症之方法，該方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之前述任一種單株抗體。在另一特定實施例中，一種治療發炎性病症之方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之前述任一種醫藥組成物。在一特定實施例中，發炎性病症為自體免疫疾病。在另一特定實施例中，發炎性病症為牛皮癬。在另一特定實施例中，發炎性病症為斑塊狀牛皮癬。在另一特定實施例中，斑塊狀牛皮癬為中度至重度牛皮癬。在另一特定實施例中，發炎性病症為紅皮症型牛皮癬。在另一特定實施例中，發炎性病症為牛皮癬性關節炎。在另一特定實施例中，發炎性病症為類風濕性關節炎。在另一特定實施例中，發炎性病症為克隆氏症(Crohn's disease)。在另一特定實施例中，發炎性病症為僵直性脊椎炎。在另一特定實施例中，發炎性病症為糖尿病。
    本發明提供特異性結合至PSGL-1之抗體。亦提供編碼此等抗體之經分離核酸。進一步提供包含編碼此等抗體或此等抗體之抗原結合片段之核酸的載體及宿主細胞。亦提供形成此等抗體、細胞(例如CHO細胞)、由此等細胞產生之抗體及純化所產生抗體之方法。本發明亦提供一種治療及/或預防本文所述之病症或疾病(例如發炎情況)之方法，該方法包含以下步驟：投予本文所述之免疫特異性結合至PSGL-1之抗體或抗體衍生之抗原結合片段。在一特定實施例中，抗體為下文實例1至實例4中所述之IgG4單株抗體15A7H。
    6.1抗體
    本發明提供免疫特異性結合至人類P選擇素醣蛋白配位體-1(「PSGL-1」)之單株抗體。在一特定實施例中，本發明提供一種免疫特異性結合至人類PSGL-1的單株抗體，該單株抗體包含：(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：3之輕鏈可變(「VL」)區；(ii)包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：4之重鏈可變(「VH」)區的重鏈；及(iii)人類IgG4恆定區，該人類IgG4恆定區在根據EU索引編號之重鏈的胺基酸228處含有絲胺酸變成脯胺酸的胺基酸取代。人類恆定區之非限制例子描述於此項技術中，參見例如Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國國家健康與人類服務部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH出版號91-3242。較佳地，該抗體結合至PSGL-1且選擇性地誘導活化T細胞凋亡(相對於其他表現PSGL-1的細胞)。在一特定實施例中，抗體結合至PSGL-1不干擾P選擇素與PSGL-1之相互作用、與PSGL-1相關之功能及活化T細胞及嗜中性球有效定位於目標組織的需要。
    在一特定實施例中，免疫特異性結合至PSGL-1之抗體為第四類全長免疫球蛋白G(IgG4)，且該抗體較佳地包含重鏈序列SEQ ID NO：2且甚至更佳地包含重鏈序列SEQ ID NO：2及輕鏈序列SEQ ID NO：1(後者為單株抗體15A7H)。
    本發明亦提供抗體之抗原結合片段，該等抗原結合片段包含可變區序列SEQ ID NO：3與SEQ ID NO：4及人類重鏈恆定區之至少一部分，該人類重鏈恆定區含有人類IgG4整個鉸鏈區且在根據EU索引編號之人類重鏈的胺基酸228處包括絲胺酸變成脯胺酸的取代。在一特定實施例中，本發明之抗體衍生抗原結合片段為F(ab')2片段。
    本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段較佳經分離的，最佳經純化。
    如本文中所用且除非另有特定說明，否則術語「免疫特異性結合」、「免疫特異性識別」、「特異性結合」及「特異性識別」在抗體及抗體衍生抗原結合片段之文義中皆為類似術語且在本文中可互換使用，且該等術語係指抗體或抗體衍生抗原結合片段經由該抗體或抗體衍生抗原結合片段之抗原結合位點結合至該抗體或抗體衍生抗原結合片段之抗原決定基，如熟習此項技術者所瞭解。在一個特定實施例中，特異性結合至抗原之抗體或抗體衍生抗原結合片段亦可結合至其他肽或多肽，但親和力通常較低，如利用例如免疫分析、BiacoreTM、KinExA 3000儀器(Sapidyne Instruments,Boise,ID)或此項技術中已知之其他分析所測定。在一特定實施例中，免疫特異性結合至抗原之抗體或抗體衍生抗原結合片段結合至抗原時的Ka為至少2個對數級、2.5個對數級、3個對數級、4個對數級或大於該抗體或該抗體衍生抗原結合片段結合至其他抗原時的Ka。在另一特定實施例中，免疫特異性結合至抗原之抗體或抗體衍生抗原結合片段不發生與其他蛋白質結合的交叉反應。在特定實施例中，本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段特異性結合至PSGL-1之天然同型異構物或天然變異體(PSGL-1之該天然同型異構物或天然變異體為可自動物、較佳自人類分離的天然存在於動物中之PSGL-1同功異型物或天然變異體)。在特定實施例中，本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段免疫特異性結合至人類PSGL-1或人類PSGL-1之片段。在特定實施例中，本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段特異性結合至人類PSGL-1及/或獼猴PSGL-1或人類PSGL-1及/或獼猴PSGL-1之片段。
    胺基酸序列SEQ ID NO：11描繪全長人類PSGL-1(GenBankTM登錄號為AAA74577.1,GI：902797)。在特定實施例中，本發明所述之抗體免疫特異性結合至PSGL-1，如藉由例如ELISA(enzyme_linked immunosorbent assay；酵素連結免疫吸附分析法)或此項技術中已知或本文所述之其他抗原結合分析所測定。
    在特定態樣中，本發明提供一種特異性結合至人類PSGL-1及/或獼猴PSGL-1之抗體，該抗體為第四類免疫球蛋白G(IgG4)(具有γ重鏈)，該第四類免疫球蛋白G為兩個經雙硫鍵鍵結之相同二聚體的四聚體，該二聚體各包含重鏈及輕鏈。該抗體較佳地包含SEQ ID NO：2之重鏈。該抗體更佳地包含SEQ ID NO：2之重鏈及SEQ ID NO：1之輕鏈。關於輕鏈，在一特定實施例中，本發明所述之抗體之輕鏈為κ輕鏈。
    在特定實施例中，本發明所述之抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：2或由胺基酸序列SEQ ID NO：2組成的重鏈。在特定實施例中，本發明所述之抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：1或由胺基酸序列SEQ ID NO：1組成的輕鏈，且包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：2或由胺基酸序列SEQ ID NO：2組成的重鏈。在特定實施例中，本發明所述之抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：1或由胺基酸序列SEQ ID NO：1組成的輕鏈。在特定實施例中，本文所述之抗體包含含有胺基酸序列SEQ ID NO：2或由胺基酸序列SEQ ID NO：2組成的重鏈。
    在一特定實施例中，本發明所述之抗體為特異性結合至PSGL-1之IgG4單株抗體。已知IgG4抗體可經歷稱作Fab臂交換(Fab arm exchange)、亦稱為IgG4重排(IgG4 shuffling)之過程，其中，天然IgG4鉸鏈雙硫鍵容易發生還原而讓重鏈分離且隨機再締合，產生重鏈與輕鏈隨機配對之IgG4分子混合群體(Aalberse等人，1999.1nt Arch Allergy Immunol 118：187-189；Labrijn等人，2009,Nat Biotechnol 27：767-771；Schuurman等人，2001.Mol Immunol 38：1-8；van der Neut Kolfschoten等人，2007.Science 317：1554-1557)。
    已證明，人類IgG4鉸鏈區中之使用Kabat編號(Kabat等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國國家健康與人類服務部，NIH出版號91-3242)之位置241處或使用EU索引(Edelman等人，1969,Proc.Natl,Acad.Sci.USA,63(1)：78-85)之位置228處的絲胺酸突變為脯胺酸引起鏈內二硫鍵形成顯著減少，從而使IgG4「半抗體」分子減少及IgG4分子之異質性/重排減少(Bloom等人，1997,Protein Sci,6：407-415；Angal等人，1993,Molecular Immunology,30(1)：105-108))。亦有公開之報導稱，此鉸鏈突變可減少IgG4重排且延長IgG4分子之活體內半衰期(Labrijn等人，2009,Nat Biotechnol 27：767-771；Stubenrauch等人，2010,Drug Metab Dispos 38：84-91)。Van der Neut Kolfschoten等人報導IgG4之CH3域而非核心鉸鏈主要牽涉於Fab臂交換反應(參見Van der Neut Kolfschoten等人，2007,Science,317：1554-1557(「Van der Neut Kolfschoten」)，第1555頁，第2欄)。Van der Neut Kolfschaten報導用IgG4之CH3域交換IgG1之CH3域可活化IgG1之Fab臂交換，而交換IgG4之CH3域中止IgG4之Fab臂交換(參見第1555頁及圖2D)。
    在一特定實施例中，本發明提供IgG4抗體或IgG4抗體之抗原結合片段，該等IgG4抗體或IgG4抗體之抗原結合片段特異性結合至PSGL-1且在IgG4鉸鏈區中含有一或多個胺基酸取代，其中該抗體或該抗體之抗原結合片段保持特異性結合至該PSGL-1，且其中IgG4重排相對於包含IgG4鉸鏈區但不包含該一或多個胺基酸取代之抗體減少。在一特定實施例中，IgG4鉸鏈區僅包含單一胺基酸取代。「人類IgG4鉸鏈區」之實例為IgG4抗體重鏈上介於CH1域與CH2域之間的區域，該區域由胺基酸序列SEQ ID NO：12組成，如Angal等人，1993,Molecular Immunology,30(1)：105-108中所述。
    在一特定實施例中，IgG4重排減少係藉由偵測鉸鏈區中含有一或多個胺基酸取代之本發明所述抗體產生半抗體分子或臂交換的量低於含有IgG4鉸鏈區但不包含該一或多個胺基酸取代之IgG4分子所產生之半抗體分子或臂交換的量來判定。此項技術中熟知之任何分析可用以偵測半抗體產生及雙特異性抗體分子。關於偵測雙特異性抗體產生之分析實例，參見例如Van der Neut Kolfschoten等人，2007,Science,317：1554-1557。
    在一特定實施例中，本發明提供特異性結合至PSGL-1之IgG4單株抗體，該IgG4單株抗體在根據EU索引編號之重鏈的胺基酸位置228處包含絲胺酸變成脯胺酸的胺基酸取代。
    在一特定實施例中，本發明所述之抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之輕鏈及在根據EU索引編號之重鏈位置228處包含脯胺酸的重鏈。
    在一特定實施例中，免疫特異性結合至人類PSGL-1的單株抗體包含：(i)具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之輕鏈；及(ii)包含人類IgG4恆定區之重鏈，該人類IgG4恆定區含有位於IgG4鉸鏈區中之一或多個胺基酸取代，其中該抗體保持特異性結合至該PSGL-1，且其中IgG4重排相對於包含IgG4鉸鏈區但不包含該一或多個胺基酸取代之抗體減少。
    在一特定實施例中，免疫特異性結合至人類PSGL-1之單株抗體包含：(i)具有胺基酸序列SEQ ID NO：1之輕鏈；及(ii)包含人類IgG4恆定區之重鏈，該人類IgG4恆定區在根據EU索引編號之重鏈胺基酸位置228處或在根據Kabat編號系統(Kabat等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國國家健康與人類服務部，NIH出版號91-3242；及Edelman等人，1969,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,63(1)：78-85)之位置241處包含絲胺酸變成脯胺酸的胺基酸取代。
    在一特定實施例中，免疫特異性結合至人類PSGL-1的單株抗體包含：(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：3之VL鏈區；(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：4之VH鏈區；及(iii)含有IgG4鉸鏈區之人類IgG4恆定區，該人類IgG4恆定區包含位於鉸鏈區中之一或多個胺基酸取代，其中該抗體保持特異性結合至PSGL-1，且其中IgG4重排相對於包含IgG4鉸鏈區但不包含該一或多個胺基酸取代之抗體減少。
    在一特定實施例中，免疫特異性結合至人類PSGL-1的單株抗體包含：(i)包含VH鏈區之重鏈，該VH鏈區包含胺基酸序列SEQ ID NO：4；及(ii)人類IgG4重鏈恆定區，該人類IgG4重鏈恆定區在根據EU索引編號之重鏈胺基酸位置228處包含絲胺酸變成脯胺酸的胺基酸取代。
    在一特定實施例中，免疫特異性結合至人類PSGL-1的單株抗體包含：(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：3之VL鏈區；(ii)包含VH鏈區之重鏈，該VH鏈區包含胺基酸序列SEQ ID NO：4；及(iii)人類IgG4重鏈恆定區，該人類IgG4重鏈恆定區在根據EU索引編號之重鏈胺基酸位置228處含有絲胺酸變成脯胺酸的胺基酸取代。
    在某些實施例中，如本文所述之IgG4單株抗體包含具有本文所述之胺基酸序列之VH CDRs(參見例如表3)及具有本文所述之胺基酸序列之VL CDRs(參見例如表2)，其中該抗體免疫特異性結合至PSGL-1，且該抗體具有減少IgG4重排之鉸鏈區突變(例如根據EU索引編號之重鏈胺基酸228處的絲胺酸變成脯胺酸的胺基酸取代)。在一特定實施例中，IgG4單株抗體免疫特異性結合至PSGL-1，且該IgG4單株抗體包含重鏈，該重鏈包含：(a)包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10之VH鏈區；(b)人類IgG4重鏈恆定區，該人類IgG4重鏈恆定區在根據EU索引編號之重鏈胺基酸228處含有絲胺酸變成脯胺酸的胺基酸取代。更佳地，抗體進一步包含輕鏈，該輕鏈包含含有SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7之VL鏈區。
    下表2呈現15A7H之胺基酸序列之VL CDRs(特定而言，VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3)。下表3呈現15A7H之胺基酸序列之VH CDRs(特定而言，VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3)。在特定實施例中，本發明所述之免疫特異性結合至人類PSGL-1(SEQ ID NO：11)之抗體包含表2中之VL CDR序列。在特定實施例中，本發明所述之免疫特異性結合至人類PSGL-1(SEQ ID NO：11)之抗體包含選自表3中之VH CDR序列的VH CDR序列。

    在一特定實施例中，本發明所述之抗體免疫特異性結合至人類PSGL-1且包含：(i)包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3之輕鏈可變(「VL」)區，該VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7；(ii)包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3之重鏈可變(「VH」)區，該VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10；及(iii)含有IgG鉸鏈區之人類IgG4重鏈恆定區，該人類IgG4重鏈恆定區包含位於鉸鏈區中之一或多個胺基酸取代，其中該抗體保持特異性結合至該PSGL-1，且其中IgG4重排相對於包含IgG4鉸鏈區但不包含該一或多個胺基酸取代之抗體減少。
    在一特定實施例中，本發明所述之抗體免疫特異性結合至人類PSGL-1且包含：(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：3之VL鏈區；(ii)包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3之VH鏈區，該VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10；及(iii)含有IgG4鉸鏈區之人類IgG4重鏈恆定區，該人類IgG4重鏈恆定區包含位於鉸鏈區中之一或多個胺基酸取代，其中該抗體保持特異性結合至PSGL-1，且其中IgG4重排相對於包含IgG4鉸鏈區但不包含該一或多個胺基酸取代之抗體減少。
    在一特定實施例中，本發明所述之抗體免疫特異性結合至人類PSGL-1且包含：(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：3之VL鏈區；(ii)包含VH鏈區之重鏈，該VH鏈區包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，該VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10；及(iii)人類IgG4重鏈恆定區，該人類IgG4重鏈恆定區在根據EU索引編號之重鏈胺基酸位置228處包含絲胺酸變成脯胺酸的胺基酸取代。
    在一特定實施例中，本發明所述之抗體免疫特異性結合至人類PSGL-1且包含：(i)包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3之VL鏈區，該VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7；(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：4之VH鏈區；及(iii)含有IgG4鉸鏈區之人類IgG4重鏈恆定區，該人類IgG4重鏈恆定區包含位於鉸鏈區中之一或多個胺基酸取代，其中該抗體保持特異性結合至PSGL-1，且其中IgG4重排相對於包含IgG4鉸鏈區但不包含該一或多個胺基酸取代之抗體減少。
    在一特定實施例中，本發明所述之抗體免疫特異性結合至人類PSGL-1且包含：(i)包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3之VL鏈區，該VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7；(ii)包含VH鏈區之重鏈，該VH鏈區包含胺基酸序列SEQ ID NO：4；及(iii)人類IgG4重鏈恆定區，該人類IgG4重鏈恆定區在根據EU索引編號之重鏈胺基酸位置228處包含絲胺酸變成脯胺酸的胺基酸取代。
    在特定實施例中，本發明所述之免疫特異性結合至PSGL-1，例如SEQ ID NO：11之人類PSGL-1多肽，之抗體包含構架區(例如VL域及VH域之構架區)。人類構架區之非限制實例描述於此項技術中，參見例如Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunologieal Interest，第五版，美國國家健康與人類服務部，NIH出版號91-3242。
    下表4呈現抗體15A7H之VL構架(FR)胺基酸序列(特定而言，VL FR1、VL FR2、VL FR3及VL FR4序列)。下表5呈現抗體15A7H之VH FR胺基酸序列(特定而言，VH FR1、VH FR2、VH FR3及VH FR4序列)。

    在某些實施例中，在鉸鏈區中具有減少IgG4重排之突變的上述IgG4抗體包含具有本文所述之胺基酸序列之VL FRs(參見表4)。在特定實施例中，本發明所述之抗體包含VL鏈區，該VL鏈區包含表1及表3之FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。
    在某些實施例中，在鉸鏈區中具有減少IgG4重排之突變的上述IgG4抗體包含具有本文所述之胺基酸序列之VH FRs(參見表5)。在特定實施例中，抗體包含VH鏈區，該VH鏈區包含表2及表4之FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。
    在另一特定實施例中，本文所述之IgG4單株抗體包含：(i)包含VL FR1、VL FR2、VL FR3及VL FR4之VL鏈區，該VL FR1、VL FR2、VL FR3及VL FR4分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16；及(ii)包含VH FR1、VH FR2、VH FR3及VH FR4之VH鏈區，該VH FR1、VH FR2、VH FR3及VH FR4分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20；且該IgG4單株抗體在鉸鏈區中具有減少IgG4重排的突變。在一特定實施例中，本發明所述之抗體包含VL鏈區，該VL鏈區包含VL FR1、VL FR2、VL FR3及VL FR4，該VL FR1、VL FR2、VL FR3及VL FR4分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16。在另一特定實施例中，本發明所述之抗體包含VH鏈區，該VH鏈區包含VH FR1、VH FR2、VH FR3及VH FR4，該VH FR1、VH FR2、VH FR3及VH FR4分別具有胺基酸序列SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20。
    在特定實施例中，本發明所述抗體之恆定區之醣化可加以修改。舉例而言，可使抗體恆定區非醣化(亦即，該抗體恆定區無醣化)或可使抗體恆定區在一或多個醣化位點包含突變或取代以消除該一或多個醣化位點處之醣化。
    醣化可經由N連接(或天冬醯胺連接)醣化或O連接醣化產生。N連接醣化包含在多肽中之天冬醯胺胺基酸之側鏈NH2基團處進行的碳水化合物修飾。O連接醣化包含在絲胺酸、蘇胺酸或羥離胺酸胺基酸之側鏈羥基處進行的碳水化合物修飾。
    在某些實施例中，非醣化抗體可產生於缺乏必要醣化機構之細菌細胞中。醣化機構改變之細胞已描述於此項技術中且可用作宿主細胞以表現本文所述之重組抗體，藉此產生醣化改變之抗體。參見例如Shields,R.L.等人，(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740；Umana等人，(1999)Nat.Biotech.17：176-1；以及歐洲專利案第EP 1,176,195號；PCT公開案WO 03/035835及WO 99/54342。
    在某些實施例中，通常可對本發明所述抗體之Fc區進行一或多種修飾以改變抗體之一或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。該等修飾在此項技術中已知且描述於例如國際專利申請公開案第WO 2008/153926 A2號中。此等修飾之實例包括，但不限於：1)改變鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數目以促進輕鏈與重鏈組裝或提高或降低抗體之穩定性；2)使抗體Fc-鉸鏈片段之CH2-CH3域界面區中的一或多個胺基酸突變以縮短抗體之生物半衰期；3)用不同胺基酸殘基置換一或多個選自胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320及322(根據Kabat之EU索引)之胺基酸，使得抗體對效應配位體具有改變之親和力，但保持親本抗體之抗原與抗體間的結合能力；及/或4)修飾以下位置(根據Kabat之EU索引)處之一或多個胺基酸以增強抗體調解抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的能力及/或提高抗體對Fcγ受體之親和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。本發明提供抗體及抗體衍生抗原結合片段，該等抗體及抗體衍生抗原結合片段免疫特異性結合至PSGL-1且可調節PSGL-1活性。在某些實施例中，本發明所提供之抗體及抗體衍生抗原結合片段免疫特異性結合至PSGL-1而此免疫特異性結合不抑制PSGL-1結合至P選擇素，且本發明所提供之抗體及抗體衍生抗原結合片段引起活化T細胞之細胞凋亡。PSGL-1活性可指此項技術中已知或所述之PSGL-1之任何活性，例如在發炎反應期間T細胞之活化。PSGL-1活性或PSGL-1功能在本文中可互換使用。在某些態樣中，PSGL-1活性由PSGL-1配位體(例如P選擇素)結合至PSGL-1來誘導。
    在某些實施例中，本發明所述之抗PSGL-1抗體或抗體衍生抗原結合片段不會阻礙或抑制P選擇素結合至PSGL-1。
    在一特定實施例中，本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段減少發炎反應期間之白血球添補作用。
    在某些態樣中，本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段減少或抑制表現PSGL-1及對PSGL-1活性信號傳導有反應之細胞(例如回應於PSGL-1配位體刺激、PSGL-1信號傳導或選擇素結合而增殖之細胞)之存活，例如誘導活化T細胞之細胞凋亡。細胞存活分析描述於此項技術中且可由熟習此項技術者容易地實施。舉例而言，細胞存活率可藉由使用錐蟲藍染色(trypan-blue staining)或此項技術中已知之其他細胞死亡或存活率標記加以評估(例如磷脂結合蛋白-1(Annexin-1)，碘化丙錠(PI)或7-AAD，參見Gerber A,Bohne M,Rasch J,Struy H,Ansorge S,Gollnick H.,2000.Investigation of annexin V binding to lymphocytes after extracorporeal photoimmunotherapy as an early marker of apoptosis.Dermatology.2000；201(2)：111-7；Coder,D.M.2001.Assessment of Cell Viability.Current Protocols in Cytometry.9.2.1-9.2.14；及Muppidi,J.、Porter,M.與Siegel,R.M.2004.Measurement of Apoptosis and Other Forms of Cell Death.Current Protocols in Immunology.59：3.17.1-3.17.36.)。
    在特定實施例中，本發明所述之抗體特異性結合至PSGL-1且抑制(例如部分地或完全地抑制)活化T細胞存活，如由本文所述或熟習此項技術者已知之方法(例如錐蟲藍排除分析，參見Coder,D.M.2001.Assessment of Cell Viability.Current Protocols in Cytometry.9.2.1-9.2.14)評估。在一些實施例中，術語「抑制」意謂降低或防止活化T細胞存活。與對照物(例如在本發明所述抗體不存在下或在非特異性抗體存在下的T細胞存活)相比，活化T細胞存活可降低約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%、約125%、約150%或大於150%。
    在某些態樣中，本發明所述之抗PSGL-1抗體能夠誘導表現PSGL-1之活化T細胞之細胞凋亡(亦即，程式性細胞死亡)。細胞凋亡分析描述於此項技術中且可由熟習此項技術者容易地實施(參見例如Muppidi,J.、Porter,M.及Siegel,R.M.2004.Measurement of Apoptosis and Other Forms of Cell Death.Current Protocols in Immunology.59：3.17.1-3.17.36)。術語「誘導」意謂起動細胞凋亡或使細胞凋亡增加而超過對照水準。可誘導活化T細胞之細胞凋亡超過對照水準(例如在本發明所述抗體不存在下或在非特異性抗體存在下的活化T細胞之細胞凋亡)約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%、約125%、約150%或大於150%。
    適用於本文關於PSGL-1活性所述之分析中的T細胞及T細胞株可容易地獲得(例如ARR、DU.528、Jurkat、H-SB2、RPMI 8402、CML-T1、Karpas 45、KE-37/SKW-3、SUP-T1、SUP-T3、MOLT 3/4、P12-Ichikawa、PF-382、CCRF-CEM、HPB-ALL、K-T1、TALL-1、MOLT 16/17、TALL-104、DND-41,Loucy、MOLT 13、Peer/Be13、HUT 78/H9、HUT 102、MT-1、DEL、JB6、Karpas 299、SU-DHL1、12H5、3DO54.8、3DO11.10、8DO51.15或3DO18.3)或可使用此項技術中已知之方法容易地鑒別(參見例如Thornton,A.M.2003.Fractionation of T and B Cells Using Magnetic Beads.Current Protocols in Immunology.55：3.5A.1-3.5A.11.；Hathcock,K.2001.T Cell Enrichment by Cytotoxic Elimination of B Cells and Accessory Cells.Current Protocols in Immunology.00：3.3.1-3.3.5.；Horgan,K.、Shaw,S.與Boirivant,M.2009.Immunomagnetic Purification of T Cell Subpopulations.Current Protocols in Immunology.85：7.4.1-7.4.9.；及Kanof,M.E.2001.Purification of T Cell Subpopulations.Current Protocols in Immunology.00：7.3.1-7.3.5)。在特定實施例中，用於細胞增殖分析之細胞或細胞株可以內生方式或重組方式表現PSGL-1。用於細胞存活率分析中之細胞或細胞株可以內生方式或重組方式表現PSGL-1且回應於PSGL-1配位體或抗PSGL-1抗體結合而發生細胞存活率變化。用於細胞凋亡分析中之細胞或細胞株可以內生方式或重組方式表現PSGL-1且回應於PSGL-1配位體或抗PSGL-1抗體結合而發生細胞凋亡變化。較佳地，該等細胞或細胞株為人類細胞或細胞株(例如ARR、DU.528、Jurkat、H-SB2、RPMI 8402、CML-T1、Karpas 45、KE-37/SKW-3、SUP-T1、SUP-T3、MOLT 3/4、P12-Ichikawa、PF-382、CCRF-CEM、HPB-ALL、K-T1、TALL-1、MOLT 16/17、TALL-104、DND-41、Loucy、MOLT 13、Peer/Be13、HUT 78/H9、HUT 102、MT-1、DEL、JB6、Karpas 299或SU-DHL1)。
    判定抗體免疫特異性結合至抗體之目標抗原的方法可容易獲得且描述於此項技術中。舉例而言，抗體對抗體之目標抗原之親和力及結合特性可由此項技術中已知之各種活體外分析方法(基於生物化學或免疫學的分析)測定，諸如平衡法(例如酵素連結免疫吸附分析(ELISA)或放射性免疫分析(RIA))或動力學(例如BiacoreTM分析)及其他方法，諸如間接結合分析、競爭性抑制分析、螢光共振能量轉移法(FRET)、免疫沉澱法、凝膠電泳及層析法(例如膠體過濾)。該等方法及其他方法可利用所檢查之一或多種組成物上之標記及/或採用各種偵測方法，包括(但不限於)色原標記、螢光標記、發光標記或同位素標記。在某些實施例中，不需要使用標記，例如，BiacoreTM系統利用表面電漿子共振(SPR)之自然現象即時遞送資料而不使用標記。
    在一特定實施例中，本發明所述之抗體經分離。在一特定實施例中，本發明所述之抗體經純化。在一特定實施例中，本發明所述之抗體為重組單株抗體。
    在一特定實施例中，本發明提供已以適於大規模生產之方式修飾的抗體或抗體衍生抗原結合片段。此修飾可包含以下步驟：將編碼抗PSGL-1抗體之必要域(諸如一或多個CDRs或RFs)的多核苷酸序列選殖至亦含有編碼合適恆定區之多核苷酸序列的合適表現載體中，以便產生完整抗體。表現載體所提供之多核苷酸序列為可經最佳化的核苷酸序列，以最大化抗體產量及細胞培養生產條件及純化過程之穩定性。
    6.2多核苷酸
    在某些態樣中，本發明提供包含編碼本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段之核苷酸序列的多核苷酸及包含重組表現於宿主細胞(例如微生物有機體，諸如大腸桿菌及哺乳動物細胞(諸如小鼠融合瘤細胞、CHO細胞及3T3纖維母細胞))中之此等多核苷酸的載體，該抗體或抗體衍生抗原結合片段免疫特異性結合至PSGL-1抗原。本發明提供包含編碼本發明所述抗體或抗體之抗體衍生抗原結合片段中之任一者之核苷酸序列的多核苷酸以及包含此等多核苷酸序列之載體，例如在宿主細胞(例如哺乳動物細胞)中有效表現的表現載體。在一特定實施例中，包含編碼本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段中之任一者之核苷酸序列的多核苷酸係經分離或純化。
    在特定態樣中，本發明提供包含編碼抗體或抗體衍生抗原結合片段之核苷酸序列的多核苷酸，該等抗體或抗體衍生抗原結合片段免疫特異性結合至PSGL-1且包含如本文所述之胺基酸序列。
    在特定實施例中，本發明所述之多核苷酸編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：2之重鏈。
    多核苷酸可包含編碼重鏈之核苷酸序列，該重鏈包含本文所述之抗體之VH FRs及CDRs(參見例如表2及表4)且進一步包含位於鉸鏈區中之降低IgG4重排之突變。
    本發明亦提供編碼包含SEQ ID NO：2之抗體重鏈之多核苷酸，該等多核苷酸經最佳化，例如藉由密碼子/RNA最佳化、用異源信號序列置換及消除mRNA非穩定性元件。本發明亦提供編碼包含SEQ ID NO：1之抗體輕鏈之多核苷酸，該等多核苷酸經最佳化，例如藉由密碼子/RNA最佳化、用異源信號序列置換及消除mRNA非穩定性元件。藉由引入密碼子變化及/或消除mRNA中之抑制性區域來產生供重組表現之編碼抗體或抗體衍生抗原結合片段之最佳化核酸的方法可藉由相應地修改例如美國專利案第5,965,726號、第6,174,666號、第6,291,664號、第6,414,132號及第6,794,498號中所述之最佳化方法實施。舉例而言，為了提高RNA之穩定性以利於重組表現，可使RNA內之潛在剪接位點及非穩定性元件(例如富A/T或A/U元件)發生突變而無需改變核酸序列所編碼之胺基酸。該等改變係利用遺傳密碼簡併，例如相同胺基酸使用替代密碼子。在某些實施例中，可能需要改變一或多個編碼保守突變(例如，化學結構及特性及/或功能與原始胺基酸相似之相似胺基酸)的密碼子。相對於尚未最佳化之多核苷酸所編碼之抗PSGL-1抗體的表現，此等方法可提高抗PSGL-1抗體或抗PSGL-1抗體之抗原結合片段的表現。此外，多核苷酸序列可經設計以匹配宿主細胞之密碼子使用偏好(例如大腸桿菌密碼子使用或CHO密碼子使用)。
    編碼本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段之最佳化多核苷酸序列可雜交至編碼本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段之非最佳化多核苷酸序列。在特定實施例中，編碼本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段之最佳化核苷酸序列可在高度嚴格條件下雜交至編碼本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段之非最佳化多核苷酸序列。在特定實施例中，編碼本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段之最佳化核苷酸序列可在高度嚴格條件、中度或低度嚴格雜交條件下雜交至編碼本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段之非最佳化核苷酸序列。已描述關於雜交條件之資訊，參見例如美國專利申請公開案第US 2005/0048549號(例如第72至73段)，該案以全文引用之方式併入本文中。
    可藉由此項技術中已知之任何方法獲得多核苷酸及測定多核苷酸之核苷酸序列。編碼本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段及該等抗體或抗體衍生抗原結合片段之修飾型的核苷酸序列可使用此項技術中熟知之方法測定，亦即，以產生編碼抗體或抗體衍生抗原結合片段之核酸的方式將已知可編碼特定胺基酸之核苷酸密碼子組裝。編碼抗體之此多核苷酸可自化學合成之寡核苷酸組裝而成(例如，如Kutmeier等人，1994,BioTechniques 17：242中所述)，例如，此組裝包括以下步驟：合成重疊寡核苷酸，該等重疊寡核苷酸含有編碼抗體或抗體衍生抗原結合片段之各部分序列；結合及接合彼等寡核苷酸；及隨後藉由PCR增幅所接合之寡核苷酸。自寡核苷酸產生合成基因之方法在此項技術中已知。
    或者，編碼本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段之多核苷酸可使用此項技術中熟知之方法(例如PCR及其他分子選殖方法)自合適來源(例如融合瘤)之核酸產生。舉例而言，使用可雜交至已知序列之3'端及5'端之合成引子進行的PCR增幅可使用自產生有興趣之抗體之細胞(例如融合瘤細胞)得到的基因組DNA執行。此等PCR增幅方法可用以獲得包含編碼抗體輕鏈及/或重鏈之序列的核酸。此等PCR增幅方法可用以獲得包含編碼抗體輕鏈可變區及/或重鏈可變區之序列的核酸。經增幅核酸可選殖至載體中以便在宿主細胞中表現及進一步選殖以例如產生嵌合抗體及人類化抗體。抗體輕鏈之恆定鏈通常為κ或λ型，對於抗體重鏈而言，恆定鏈可為(但不限於)任何IgG同型(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)或其他免疫球蛋白，包括對偶基因變異體。
    若含有編碼特定抗體之核酸株不可得，但已知抗體分子之序列，則編碼免疫球蛋白之核酸可使用此項技術中熟知之任何方法進行化學合成且選殖至可複製的選殖載體中。
    編碼本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段的DNA可使用習知程序(例如使用能夠特異性結合至編碼抗體重鏈及輕鏈之核酸的寡核苷酸探針)容易地分離且定序。DNA一經分離，即可置放至表現載體中，隨後將該等表現載體轉染至原核或真核宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、酵母(畢赤酵母菌屬、酵母菌屬)、類人猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、骨髓瘤細胞(NS0)、昆蟲或植物細胞)中(否則不會產生免疫球蛋白蛋白質)，以實現抗體或抗體衍生抗原結合片段在重組宿主細胞中之合成。
    6.3宿主細胞及抗體之重組表現
    在某些態樣中，本發明提供重組表現本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段及相關表現載體的宿主細胞。本發明提供包含多核苷酸之表現載體，該等多核苷酸包含編碼本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段的核苷酸序列，該等抗體或抗體衍生抗原結合片段可重組表現於原核及真核宿主細胞中，較佳表現於哺乳動物細胞中。本發明亦提供宿主細胞，該等宿主細胞包含此等表現載體以便重組表現本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段。在一特定態樣中，本發明提供產生本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段之方法，該方法包含以下步驟：自宿主細胞表現此抗體或抗體衍生抗原結合片段。
    重組表現免疫特異性結合至PSGL-1抗原的本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段包含以下步驟：建構含有多核苷酸之表現載體，該多核苷酸編碼該抗體或抗體衍生抗原結合片段。一旦獲得編碼本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段之多核苷酸，則可使用此項技術中熟知之技術、藉由重組DNA技術產生供製備該抗體或抗體衍生抗原結合片段用的載體。因此，本文描述藉由表現含有抗體或抗體衍生抗原結合片段編碼核苷酸序列之多核苷酸來製備抗體或抗體衍生抗原結合片段的方法。熟習此項技術者熟知之方法可用以建構含有抗體編碼序列或抗體衍生抗原結合片段編碼序列及適當轉錄與轉譯控制信號的表現載體。此等方法包括例如活體外重組DNA技術、合成技術及活體內基因重組。亦提供可複製載體，該等可複製載體包含編碼本發明所述抗體、抗體重鏈或輕鏈、抗體重鏈或輕鏈可變域、或抗體衍生抗原結合片段之核苷酸序列，該核苷酸序列可操作地聯結至啟動子，特定而言，為表現於哺乳動物細胞中而提供之啟動子。此等載體可包括編碼抗體分子恆定區之核苷酸序列(參見例如國際公開案第WO 86/05807號及第WO 89/01036號；及美國專利案第5,122,464號)，且可將抗體之可變域選殖至此載體中用於整個重鏈、整個輕鏈、或整個重鏈與整個輕鏈兩者之表現。表現載體包括質體、反轉錄病毒、黏質體、EBV衍生之游離基因體、人工染色體及以上各者之類似者。表現載體及表現控制序列可經選擇以與宿主細胞相容。重組表現載體亦可編碼信號肽，該信號肽促進宿主細胞分泌抗體鏈。信號肽可為免疫球蛋白信號肽、來自非免疫球蛋白蛋白質之異源肽或人工肽。
    藉由此項技術中已知之習知技術(例如脂質體媒介的轉染、聚陽離子媒介的轉染、原生質體融合、顯微注射、磷酸鈣沉澱、電穿孔、藉由病毒載體轉移)將表現載體轉移至宿主細胞中，且隨後藉由習知技術培養經轉染細胞以產生本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段。因此，本發明提供含有編碼本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段之多核苷酸的宿主細胞，該多核苷酸可操作地聯結至異源啟動子。在針對雙鏈抗體表現之某些實施例中，編碼重鏈與輕鏈兩者之載體可共表現於宿主細胞中以便表現完整免疫球蛋白分子，如下文詳細描述。在某些實施例中，宿主細胞含有包含多核苷酸之載體，該多核苷酸編碼本發明所述抗體或該抗體之抗原結合片段之重鏈與輕鏈兩者。在特定實施例中，宿主細胞含有兩個不同載體，第一載體包含編碼本發明所述抗體或該抗體之片段(例如該抗體之抗原結合片段)之重鏈的多核苷酸，且第二載體包含編碼本發明所述抗體或該抗體之片段(例如該抗體之抗原結合片段)之輕鏈的多核苷酸。在其他實施例中，第一宿主細胞包含第一載體，該第一載體包含編碼本發明所述抗體或該抗體之片段之重鏈的多核苷酸，且第二宿主細胞包含第二載體，該第二載體包含編碼本發明所述抗體之輕鏈的多核苷酸。
    各種宿主表現載體系統可用以表現本發明所述之抗體分子或抗體衍生抗原結合片段(參見例如美國專利案第5,807,715號及美國專利案第7.604,800號)。此等宿主表現系統不僅代表所關注之編碼序列可藉以產生且隨後純化的運載工具，而且亦代表細胞，該等細胞在用適當核苷酸編碼序列轉型或轉染時可原位表現本發明所述之抗體分子或抗體衍生抗原結合片段。該等表現載體系統包括(但不限於)微生物，諸如用含有抗體編碼序列或抗體衍生抗原結合片段編碼序列之重組噬菌體DNA表現載體、質體DNA表現載體或黏質體DNA表現載體轉型的細菌(例如大腸桿菌及枯草桿菌)；用含有抗體編碼序列或抗體衍生抗原結合片段編碼序列之重組酵母表現載體轉型的酵母(例如酵母菌屬、畢赤酵母菌屬)；用含有抗體編碼序列或抗體衍生抗原結合片段編碼序列之重組病毒表現載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；用重組病毒表現載體(例如花椰菜鑲嵌病毒CaMV、煙草鑲嵌病毒TMV)感染或用含有抗體編碼序列或抗體衍生抗原結合片段編碼序列之重組質體表現載體(例如Ti質體)轉型的植物細胞系統(例如綠藻，諸如萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))；或具有重組表現構築體的哺乳動物細胞系統(例如COS、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa及NIH 3T3細胞)，該等重組表現構築體含有衍生自哺乳動物細胞基因體之啟動子及/或強化子(例如金屬硫蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、肌動蛋白啟動子)或衍生自哺乳動物病毒之啟動子及/或強化子(例如腺病毒晚期啟動子、牛痘病毒7.5K啟動子、CMV、類人猿病毒40)。用於真核細胞表現之其他調控元件為聚腺苷酸化信號，諸如BGH polyA、SV40晚期或早期polyA。或者，可使用免疫球蛋白基因或其他基因之聚腺苷酸化信號。在另一特定實施例中，真核細胞(尤其是表現本發明所述之IgG4單株抗體的真核細胞)用於表現本發明所述之抗體或該抗體之抗原結合片段。舉例而言，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞之哺乳動物細胞聯合載體(諸如來自人類細胞巨大病毒之主要中間早期基因啟動子元件)為抗體之有效表現系統(Foecking等人，1986,Gene 45：101及Cockett等人，1990,Bio/Technology 8：2)。在某些實施例中，本發明所述之抗體由CHO細胞或NS0細胞產生。在一特定實施例中，表現編碼本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段的核苷酸序列係由組成性啟動子、可誘導啟動子或組織特異性啟動子調控，該等抗體或抗體衍生抗原結合片段免疫特異性結合至PSGL-1抗原。
    視所表現之抗體分子之預定用途而定，可有利地選擇表現載體在細菌系統中的數目。舉例而言，當欲產生大量此類抗體或抗體衍生抗原結合片段以便產生抗體分子或抗體衍生抗原結合片段之醫藥組成物時，可能需要載體引導易純化之融合蛋白質產物高量表現。
    此外，可選擇宿主細胞株，該宿主細胞株調節插入序列之表現或以所要之特定方式修飾且加工基因產物。蛋白質產物之此等修飾(例如醣化)及加工對於蛋白質功能可為重要的。不同宿主細胞對於蛋白質及基因產物之轉譯後加工及修飾而言具有特定的特徵性機制。可選擇適當細胞株或宿主細胞以確保正確修飾及加工所表現之外來蛋白。為此，可使用真核宿主細胞，該等真核宿主細胞具有基因產物之初始轉錄、醣化及磷酸化之細胞適當加工機構。此等哺乳動物宿主細胞包括但不限於CHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O及T47D、NS0(不以內源方式產生任何免疫球蛋白鏈之小鼠骨髓瘤細胞系)、CRL7O3O及HsS78Bst細胞。在某些實施例中，本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段產生於哺乳動物細胞(諸如CHO細胞)中。
    欲長期高產量製備重組抗體或抗體衍生抗原結合片段，則穩定表現為較佳。舉例而言，可設計出穩定表現抗體分子或抗體衍生抗原結合片段之哺乳動物細胞系。可使用由適當表現控制元件(例如啟動子、強化子、序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點等)及可選擇標記控制的DNA(而不是使用含有病毒複製起點的表現載體)來使宿主細胞轉型。在引入外源DNA後，可允許所設計之細胞在非選擇性培養基中生長1至2天且隨後將該等細胞轉移至選擇性培養基中。重組質體中之可選擇標記賦予選擇抗性且允許細胞穩定地將質體整合至該等細胞之染色體中。在單一細胞選殖後，細胞擴增為生產細胞株。此方法可有利地用以設計表現抗體分子或抗體衍生抗原結合片段之細胞株。此等經設計細胞株可特別適用於篩選及評估與抗體分子直接或間接相互作用之組成物。
    可使用多種選擇系統，該等選擇系統包括(但不限於)可分別用於胸苷激酶細胞、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶細胞及腺嘌呤磷酸核糖轉移酶細胞中之單純皰疹病毒胸苷激酶基因(Wigler等人，1977,Cell 11：223)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因(Szybalska與Szybalski,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：202)及腺嘌呤磷酸核糖轉移酶基因(Lowy等人，1980,Cell 22：8-17)。另外，抗代謝物抗性可用作以下基因之選擇基礎：賦予胺甲葉酸抗性的dhfr(Wigler等人，1980,Natl.Acad.Sci.USA 77：357；O'Hare等人，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527)；賦予黴酚酸抗性的gpt(Mulligan與Berg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072)；賦予胺基醣苷G-418抗性的neo(Wu與Wu,1991,Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan,1993,Science 260：926-932及Morgan與Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62：191-217；May,1993,TIB TECH 11(5)：155-2 15)；及賦予濕黴素抗性的hygro(Santerre等人，1984,Gene 30：147)。重組DNA技術中普遍已知之方法通常可應用於選擇所要重組株，且此等方法描述於例如Ausubel等人(編)，Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons,NY(1993)；Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)；及Dracopoli等人(編)，Current Protocols in Human Genetics,John Wiley & Sons,NY(1994)第12章與第13章；Colberre-Garapin等人，1981,J.Mol.Biol.150：1中，此等文獻以全文引用之方式併入本文中。
    抗體分子或抗體衍生抗原結合片段之表現量可藉由載體增幅來提高(欲回顧，參見Bebbington與Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，第3卷(Academic Press,New York,1987))。當表現抗體或抗體衍生抗原結合片段之載體系統中的標記可增幅時，提高存在於宿主細胞培養物中之抑製劑含量將增加標記基因之複本數目。因為經增幅之區域與抗體或抗體衍生抗原結合片段基因相關，所以抗體或抗體衍生抗原結合片段之產量將提高(Crouse等人，1983,Mol.Cell.Biol.3：257)。
    宿主細胞可用本文所述之兩個或兩個以上表現載體共轉染，第一載體編碼重鏈衍生多肽且第二載體編碼輕鏈衍生多肽。兩個載體可含有相同可選擇標記或不同選擇標記，該等標記使得重鏈多肽及輕鏈多肽能夠充分表現。宿主細胞可用不同量之兩個或兩個以上表現載體共轉染。
    或者，可使用單一載體，該載體編碼重鏈多肽及輕鏈多肽兩者且能夠表現重鏈多肽及輕鏈多肽兩者。重鏈及輕鏈之編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。表現載體可為單順反子載體或多順反子載體。舉例而言，雙順反子核酸構築體可以如下順序包含啟動子、本文所述之抗體之重鏈及本文所述之抗體之輕鏈。在此表現載體中，兩個鏈之轉錄可由啟動子驅動，然而來自重鏈之mRNA之轉譯可由帽依賴性掃描機制驅動且來自輕鏈之mRNA之轉譯可由帽非依賴性機制(例如核榶體內起始位(IRES))驅動。
    在一些實施例中，藉由將宿主細胞培養足以允許宿主細胞高度表現分子的時間段來產生抗體分子或抗體衍生抗原結合片段。在一些實施例中，分子表現於哺乳動物細胞中，例如無血清培養基或化學限定培養基中的CHO細胞中。在一些實施例中，抗體分子或抗體衍生抗原結合片段作為分泌多肽自培養基回收，或該等抗體分子或抗體衍生抗原結合片段若例如在無分泌信號之情況下表現，則可自宿主細胞溶解產物中回收。
    本發明所述之抗體分子或抗體衍生抗原結合片段一旦藉由重組表現產生，則可藉由此項技術中已知之任何純化免疫球蛋白分子的方法純化，例如層析法(例如離子交換層析法、親和力層析法(尤其是利用對特異性抗原之親和力低於對蛋白質A之親和力)及篩分管柱層析法)、離心、差異溶解度、沉澱作用、過濾作用、反相HPLC法或純化蛋白質的任何其他標準技術，從而獲得實質上均質的且具有生物活性的分子製劑。此外，本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段可融合至異源多肽序列以促進純化。
    在特定實施例中，本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段經分離或純化。舉例而言，在特定實施例中，本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段之製劑實質上不含細胞物質、培養基組分及/或化學前驅物。術語「實質上不含細胞物質」包括抗體或抗體衍生抗原結合片段之製劑，其中該抗體或抗體衍生抗原結合片段已與析出或重組產生該抗體或抗體衍生抗原結合片段的細胞之細胞性組分分離。當重組產生抗體或抗體衍生抗原結合片段時，該抗體或抗體衍生抗原結合片段通常亦實質上不含培養基，亦即，培養基在蛋白質製劑體積中小於約20%、10%、2%、1%、0.5%或0.1%。當抗體或抗體衍生抗原結合片段藉由化學合成產生時，該抗體或抗體衍生抗原結合片段通常實質上不含化學前軀物或其他化學物質，亦即，該抗體或抗體衍生抗原結合片段與涉及蛋白質合成的化學前驅物或其他化學物質分離。因此，除關注之抗體或關注之抗體衍生抗原結合片段之外，抗體或抗體衍生抗原結合片段之此等製劑具有小於約30%、20%、10%、5%(以乾重計)之化學前驅物或化合物。
    6.4醫藥組成物
    本發明提供包含本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段之組成物、醫藥組成物。在特定態樣中，本發明所述之組成物可活體外、活體內或連接於活體使用。在特定實施例中，本發明提供包含本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段及醫藥學上可接受之載體或賦形劑的醫藥組成物。
    可藉由混合具有所要純度之抗體與可選的生理上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.,Easton,PA；Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版.(2006)Lippincott Williams & Wilkins,Baltimore,MD)而製備含有本發明所提供之抗體或抗體衍生抗原結合片段的治療組成物以便以凍乾調配物或水溶液之形式儲存。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對於接受者而言為無毒的，且可接受之載劑、賦形劑或穩定劑包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、脫水檸檬酸鈉及其他有機酸；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
    組成物(諸如本發明所述組成物)亦可含有治療特定適應症所需要的一種以上活性化合物(例如分子，例如抗體或本發明所述抗體)。在某些實施例中，調配物包含本發明提供之抗體或抗體衍生抗原結合片段及具有彼此間無不利影響之互補活性的一或多種活性化合物。此等分子宜以對預期目標有效之量組合存在。舉例而言，本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段可與一或多種其他治療劑組合。此組合療法可連續或同時或依序投予患者。
    用於活體內投予之組成物可為無菌組成物。此舉容易藉由過濾(例如經由無菌過濾膜過濾)實現。
    在特定態樣中，本發明提供之醫藥組成物在醫藥學上可接受之載劑中含有治療有效量之本發明所提供抗體或抗體衍生抗原結合片段及視情況存在的一或多種其他預防性或治療性藥劑。此等醫藥組成物適用於預防及/或治療本文所述之病症或疾病，諸如牛皮癬或牛皮癬之一或多種症狀。術語「治療有效量」係指安全有效預防或治療疾病之量。如本文所用，術語「治療」在本文中用以意謂在患有疾病之個體中提供有利或所要臨床效果的手段。有利或所要臨床效果包括(但不限於)緩和症狀、降低疾病程度、穩定(亦即，不惡化)疾病病況、延遲或減慢疾病之進展、改善或減輕疾病病況、及無論是部分還是總體地好轉(無論是可偵測的還是不可偵測的)。「治療」亦可意謂與若不接受治療之預期存活時間相比，存活時間延長。
    適合於投予本發明所提供抗體或抗體衍生抗原結合片段之醫藥載劑包括熟習此項技術者已知之適合於特定投藥模式的任何此等載劑。在一個實施例中，抗體或抗體衍生抗原結合片段調配成適合醫藥製劑，諸如非經腸投藥之無菌溶液或懸浮液。
    此外，本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段可作為唯一醫藥活性成分調配於組成物中或可與其他活性成分(諸如一或多種其他預防性或治療性藥劑)組合。
    在組成物中，本發明提供之抗體或抗體衍生抗原結合片段與適合醫藥載劑混合。一經投予，組成物中之抗體或抗體衍生抗原結合片段濃度例如可有效傳遞預防及/或治療本文所述病症或疾病(例如發炎性病症)或該病症或疾病之症狀的量。
    在一個實施例中，組成物調配成可以單一劑量投予。為了調配組成物，將重量部分之化合物以有效濃度溶解、懸浮、分散或以其他方式混合於所選載劑中，以便減輕、治療病症或改善一或多種症狀。
    在某些態樣中，本發明提供之抗體或抗體衍生抗原結合片段以有效量包括於醫藥上可接受之載劑中，該有效量足以對所治療患者產生治療上有用之效果而不存在不良副作用或不良副作用最小或可忽略。可藉由使用常規方法在活體外及活體內系統中測試化合物來基於經驗判定治療有效濃度，且隨後自該濃度推測用於人類之劑量。
    醫藥組成物中之抗體或抗體衍生抗原結合片段之濃度將取決於例如抗體或抗體衍生抗原結合片段之物理化學特性、給藥時程及投藥量以及熟習此項技術者已知之其他因素。
    在另一實施例中，醫藥組成物提供每天每公斤體重約0.001 mg至約100 mg抗體或抗體衍生抗原結合片段之劑量。可製備醫藥單位劑型以提供每單位劑型約0.001 mg至100 mg必要成分及/或其他可選必要成分之組合。在一特定實施例中，抗體或抗體衍生抗原結合片段的調配濃度為40 mg/mL。
    抗體或抗體衍生抗原結合片段可一次性投予或可分為若干較小劑量以每隔一段時間投予。應理解，精確劑量及治療持續時間為本文所述之所治療疾病或病症之函數且可使用已知測試方案或利用活體內或活體外測試資料外推而基於經驗判定。應注意，濃度及劑量值亦可隨著待改善之疾病或病症之嚴重程度而變。此外應理解，任何特定個體的具體給藥方案可根據個別需要及投藥者或組成物投藥監督者的專業判斷而隨著時間調整。
    投予人類及動物的醫藥組成物可以單位劑型提供，諸如含有適量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段的無菌非經腸溶液或懸浮液。在一個實施例中，抗體或抗體衍生抗原結合片段以單位劑型或多劑型調配及投予。如本文中所用之單位劑型指在實體上離散之單元，該等離散單元適合於人類個體及動物個體且如此項技術中所知個別地封裝。各單位劑型含有足以產生所要治療效果的預定量之抗體或抗體衍生抗原片段，與所需醫藥載劑、媒介物或稀釋劑。單位劑型之實例包括安瓿及注射器。單位劑型可以小部分或多個小部分投予。多劑型為封裝於單一容器中待以隔離單位劑型投予之複數個相同單位劑型。多劑型之實例包括小瓶，或品脫瓶(bottles of pints)或加侖瓶(bottles of gallons)。因此，多劑型為在封裝時未隔離之多個單位劑型。
    在某些實施例中，本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段存在於液體醫藥組成物中。舉例而言，液體投藥組成物可藉由將本發明所述之抗體溶解、分散或以其他方式混合於載劑(諸如水、鹽水、右旋糖水溶液、甘油、乙二醇、乙醇及以上各者之類似物)中，藉此形成溶液或懸浮液。若需要，則待投予之醫藥組成物亦可含有少量無毒助劑，諸如濕潤劑、乳化劑、助溶劑及pH緩衝劑及以上各者之類似物。
    熟習此項技術者已知或將顯而易知製備此等劑型之實際方法，例如，參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.,Easton,PA；Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版(2006)Lippincott Williams & Wilkins,Baltimore,MD。
    可製備含有0.005%至99.9%範圍內之抗體及由無毒載劑構成之剩餘部分的劑型或組成物。熟習此項技術者已知製備此等組成物之方法。
    在一個實施例中，非經腸投藥之特徵為皮下注射、肌肉內注射或靜脈內注射，該等注射方式亦涵蓋於本發明中。血管注射劑可製備為習知形式，如液體溶液或懸浮液、適合於在注射前於液體中成為溶液或懸浮液的固體形式、或乳液。血管注射劑、溶液及乳液亦含有一或多種賦形劑。合適賦形劑為例如水、鹽水、右旋糖、甘油或乙醇。此外，若需要，則待投予之醫藥組成物亦可包含少量無毒助劑，諸如濕潤劑或乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑、增溶劑及其他此等藥劑。其他投藥途徑可包括經腸投藥、大腦內投藥、經鼻投藥、動脈內投藥、心內投藥、骨內注入、脊髓內投藥、靜脈內輸注、皮下植入或注射、肌肉內投藥、直腸內投藥、陰道內投藥、胃內投藥、氣管內投藥、肺內投藥及腹膜內投藥。
    非經腸投予之製劑包括為即用型無菌注射溶液；無菌乾燥可溶性產物，諸如凍乾粉末，待臨用前與溶劑合併(包括即用型無菌注射懸浮液)；無菌乾燥不可溶產物，待臨用前與媒介物合併；及無菌乳液。溶液可為水溶液或無水溶液。
    若靜脈內投藥，則合適載劑包括生理鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、水及含有增稠劑及助溶劑(諸如葡萄糖、聚乙二醇及聚丙二醇及以上各者之混合物)之溶液。
    用於非經腸製劑中之醫藥學上可接受之載劑包括含水媒介物、無水媒介物、抗微生物劑、等張劑、緩衝劑、抗氧化劑、局部麻醉劑、懸浮與分散劑、乳化劑、鉗合劑或螯合劑及其他在醫藥學上可接受之物質。醫藥載劑亦包括用於水混溶性媒介物之乙醇、聚乙二醇及丙二醇；及用於調節酸鹼值之氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。
    作為說明，靜脈內注射或動脈內注射含有抗體之無菌水溶液為有效投藥模式。另一實施例為需要注射含有活性物質之無菌水性或油性溶液或懸浮液，以產生所要醫藥學效果。
    在一特定實施例中，醫藥製劑包含檸檬酸鈉、氯化鈉、檸檬酸、聚山梨醇酯80及水。在一特定實施例中，醫藥製劑包含檸檬酸鈉、氯化鈉及檸檬酸。在一特定實施例中，醫藥製劑包含9.1 mM檸檬酸鈉、150 mM氯化鈉及0.9 mM檸檬酸。在一特定實施例中，醫藥製劑包含濃度為0.267 mM之本發明所述抗體或共軛物。在一特定實施例中，醫藥製劑包含2.676 g/L檸檬酸鈉、8.766 g/L氯化鈉、0.2 g/L聚山梨醇酯80及0.189 g/L檸檬酸。在一特定實施例中，醫藥製劑包含濃度為40 g/L之本發明所述之抗體或抗體衍生抗體結合片段。較佳地，前述醫藥製劑pH值為6.0。
    在其他實施例中，醫藥組成物為凍乾粉末，該等凍乾粉末可復原為溶液、乳劑及其他混合物投予。該等醫藥組成物亦可復原及調配為固體或凝膠。
    凍乾粉末如下製備：將本發明所述之抗體溶解於合適溶劑中。在一些實施例中，凍乾粉末為無菌的。溶劑可含有賦形劑，該賦形劑提高粉末或由粉末製備之復原溶液之其他醫藥組分的穩定性。可用之賦形劑包括(但不限於)右旋糖、山梨醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、丙三醇、葡萄糖、蔗糖或其他合適藥劑。溶劑亦可含有緩衝劑，諸如檸檬酸鹽、磷酸鈉或磷酸鉀或熟悉此項技術者已知之其他此類緩衝劑，在一個實施例中，約呈中性pH。接著將該溶液無菌過濾，隨後在熟悉此項技術者已知之標準條件下進行凍乾，從而得到所要調配物。在一個實施例中，所得溶液將分配至小瓶中供凍乾。各瓶含有單劑量之化合物或多劑量之化合物。凍乾粉末可儲存於適宜條件下，諸如約4℃至室溫。
    此凍乾粉末經注射用水復原，得到用於非經腸投藥之調配物。復原時，將凍乾粉末添加至無菌水或其他合適載劑中。精確量取決於所選化合物。此量可基於經驗而判定。
    6.5治療方法
    本發明所述之抗體及抗體衍生抗原結合片段適用於治療與活化T細胞的增殖增強及/或大量活化T細胞相關或(完全或部分)由活化T細胞的增殖增強及/或大量活化T細胞引起的病症或疾病，活化T細胞的增殖增強及/或大量活化T細胞係相對於健康個體或不患有該特定病症或疾病之個體中所發現的活化T細胞之增殖及/或活化T細胞數目而言。此等疾病及病症已為熟悉此項技術者所知或可由熟習此項技術者確定。在一特定實施例中，本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段適用於治療發炎性疾病或病症。在一個實施例中，發炎性疾病為自體免疫疾病。在一特定實施例中，發炎性疾病或病症為牛皮癬、斑塊狀牛皮癬、牛皮癬性關節炎、類風濕性關節炎、克隆氏症及僵直性脊椎炎。
    可用本發明所述抗體及抗體衍生抗原結合片段治療之病症及疾病之非限制實例包括牛皮癬、克隆氏症、僵直性脊椎炎、關節炎(包括類風濕性關節炎、青少年類風濕性關節炎、骨關節炎及牛皮癬性關節炎)、糖尿病、多發性硬化症、腦脊髓炎、重症肌無力、全身性紅斑狼瘡、自體免疫甲狀腺炎、皮膚炎(包括異位性皮膚炎及濕疹性皮炎)、休格倫氏症(Sjogren's Syndrome)、口瘡性潰瘍口內炎、虹膜炎、結膜炎、角膜結膜炎、第一型糖尿病、發炎性腸疾病、潰瘍性結腸炎、哮喘、過敏性哮喘、皮膚紅斑狼瘡、硬皮病、陰道炎、直腸炎、藥疹、麻風病逆向反應、麻瘋結節性紅斑、自體免疫葡萄膜炎、過敏腦脊髓炎、急性出血性壞死性腦病、自發性兩側進行性感音神經性聽覺喪失、再生不全性貧血、純紅細胞貧血、自發性血小板減少、多軟骨炎、華格納氏肉芽腫(Wegener's granulomatosis)、慢性活動性肝炎、史蒂芬-瓊森症候群(Stevens-Johnson syndrome)、自發性腹瀉、扁平苔蘚、格雷氏病(Graves' disease)、類肉瘤病、原發性膽汁性肝硬化、後段葡萄膜炎、間質性肺纖維化、過敏症(諸如異位性過敏症)、AIDS及T細胞瘤(諸如白血病或淋巴瘤)。
    此外，抗體及抗體衍生抗原結合片段適用於預防及/或治療與活化T細胞的增殖增強及/或大量活化T細胞相關或(完全或部分)由活化T細胞的增殖增強及/或大量活化T細胞引起的某些病症或疾病，活化T細胞的增殖增強及/或大量活化T細胞係相對於健康個體或不患有特定病症或疾病之個體中所發現的活化T細胞之增殖及/或數目而言。使用本發明所述之抗體及抗體衍生抗原結合片段可預防及/或治療之病症及疾病之非限制實例包括移植物抗宿主病及移植排斥反應個案(包括使用同種異體組織或異種組織之移植排斥反應)，諸如骨髓移植、肝移植、腎移植或任何器官或組織之移植。
    因此，本發明提供使用本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段預防及治療本文所述之疾病及病症之方法。在一特定實施例中，此等方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。在特定實施例中，為治療本文所述之病症或疾病而投予的抗體為15A7H。
    在一個實施例中，「治療」病症或病症係指改善疾病或病症或改善該疾病或病症之至少一個可辨症狀。在另一實施例中，「治療」係指改善至少一種與疾病或病症相關、但個體不一定能辨別的可測身體參數。在又一實施例中，「治療」係指在身體上(例如可辨症狀穩定化)或在生理上(例如身體參數穩定化)或在身體上與生理上抑制疾病或病症之進展。
    在特定實施例中，提供本文所述之治療方法用於減輕或改善本文所述之病症或疾病之進展、嚴重程度及/或持續時間。在其他特定實施例中，本文所述之治療方法減輕本文所述之病症或疾病之一或多個症狀。
    在一特定實施例中，歸因於投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段，用於治療本文所述之病症或疾病之方法可達成以下效果中之至少一者、至少兩者、至少三者、至少四者或四者以上：(i)減輕或改善病症或疾病及/或與該病症或疾病相關之一或多個症狀之嚴重程度；(ii)減少與病症或疾病相關之一或多個症狀之持續時間；(iii)預防病症或疾病之復發；(iv)病症或疾病或與該病症或疾病相關之一或多個症狀消退；(v)減少個體住院；(vi)減少住院期長度；(vii)增加個體之存活；(viii)抑制病症或疾病及/或與該病症或疾病相關之一或多個症狀之進展；(ix)增強或改善另一療法之治療效果；(x)減輕或消除病症或疾病；(xi)減少死亡率；(xii)降低住院率；(xiii)預防與病症或疾病相關之一或多個症狀之發展或發作。
    在一個實施例中，「預防」病症或疾病係指完全或部分地抑制異常或疾病之發作或發展。
    在一特定實施例中，根據本文所述之方法治療之疾病或病症為牛皮癬。一般認為T淋巴球在牛皮癬之發病機制中起關鍵作用。在一特定實施例中，用於治療牛皮癬之方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。在另一特定實施例中，用於改善或預防牛皮癬之一或多個症狀之方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。牛皮癬之症狀包括(但不限於)：皮膚出現銀色鱗片覆蓋之紅色斑塊，皮膚出現凸起斑塊，皮膚上之鱗狀小斑點，皮膚乾燥，皮膚燥裂(包括膿皰)，皮膚搔癢，指甲增厚、指甲有凹痕或指甲成脊狀，關節腫脹及關節僵硬。
    在另一實施例中，根據本文所述之方法治療之疾病或病症為斑塊狀牛皮癬。斑塊狀牛皮癬或尋常型牛皮癬為牛皮癬之最常見形式且以由銀色鱗片覆蓋之界限明顯、凸出的紅斑性皮膚斑塊為特徵。病變傾向於包括胺端、腰骶區及頭皮之伸肌表面。相應組織病理學發現包括真皮與表皮之明顯發炎性細胞浸潤、擴張血管數增加、及表皮實質性增厚伴隨角質細胞病變性分化與過度角化。斑塊狀牛皮癬患者中約三分之一歸類為患有中度或重度疾病且因此為僅局部治療不足以達成治療的候選者。
    在一特定實施例中，用於治療斑塊狀牛皮癬之方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。在另一特定實施例中，用於改善或預防斑塊狀牛皮癬之一或多個症狀之方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。斑塊狀牛皮癬之症狀包括(但不限於)：皮膚出現銀色鱗片覆蓋之紅色斑塊，皮膚出現凸起斑塊，皮膚上之鱗狀小斑點，皮膚乾燥，皮膚燥裂(包括膿皰)，皮膚搔癢，指甲增厚、指甲有凹痕或指甲成脊狀，關節腫脹及關節僵硬。
    在另一實施例中，根據本文所述之方法治療之病症為慢性斑塊狀牛皮癬。在一特定實施例中，用於治療慢性斑塊狀牛皮癬之方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。在另一特定實施例中，用於改善或預防慢性斑塊狀牛皮癬之一或多個症狀之本發明所述方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。斑塊狀慢性牛皮癬之症狀包括(但不限於)身體任何部位(包括(但不限於)膝蓋、肘、腰骶區、頭皮及指甲)之皮膚上出現的單一或多個凸出紅斑(範圍為硬幣大小至更大)。
    在另一實施例中，根據本文所述之方法治療之病症為疹狀牛皮癬。在另一特定實施例中，用於治療疹狀牛皮癬之方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。在另一特定實施例中，用於預防或改善疹狀牛皮癬之一或多個症狀之方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。疹狀牛皮癬之症狀包括(但不限於)皮膚上水滴形鱗斑發紅及隨後感染(諸如鏈球菌咽喉感染)。
    在另一實施例中，根據本文所述之方法治療之疾病或病症為反轉型牛皮癬。在特定實施例中，用於治療反轉型牛皮癬(亦稱為擦爛性牛皮癬及屈側性牛皮癬)方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。在另一特定實施例中，用於預防或改善反轉型牛皮癬之一或多個症狀之方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。反轉型牛皮癬之症狀包括(但不限於)在一或多個以下身體部位之皮膚上出現光滑且通常潮濕的區域：腋窩、腹股溝、乳房下方及生殖器與臀部周圍之其他皮膚褶皺中，不同於與斑塊狀牛皮癬相關之鱗片狀，該等區域發紅且發炎。
    在另一實施例中，根據本文所述之方法治療之疾病或病症為膿皰型牛皮癬。在一特定實施例中，用於治療膿皰型牛皮癬之方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。在另一特定實施例中，本文所述之用於預防或改善膿皰型牛皮癬之一或多個症狀之方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。膿皰型牛皮癬之症狀包括(但不限於)充滿膿液之水泡，該等水泡的尺寸及位置不同，但大部分位於手及腳上。
    在另一實施例中，根據本文所述之方法治療之疾病或病症為紅皮病型牛皮癬。在一特定實施例中，用於治療紅皮病型牛皮癬之方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。在另一特定實施例中，本文所述之用於預防或改善紅皮病型牛皮癬之一或多個症狀之方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。紅皮病型牛皮癬之症狀包括(但不限於)皮膚之週期性廣泛性熾烈發紅及大片鱗片(而非較小碎片)脫落。皮膚發紅及脫落通常伴隨著嚴重搔癢及疼痛、心率增快以及體溫波動。
    在另一實施例中，根據本文所述之方法治療之疾病或病症為風濕性關節炎。在一特定實施例中，用於治療風濕性關節炎之方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。在另一特定實施例中，本文所述之用於預防或治療風濕性關節炎之一或多個症狀之方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。風濕性關節炎之症狀包括(但不限於)疲勞、食欲不振、低燒、腺腫脹、虛弱、腕關節疼痛、肘關節疼痛、肩關節疼痛、髖骨關節疼痛、膝關節疼痛、踝關節疼痛、趾關節疼痛、顎關節疼痛、手關節疼痛、腳關節疼痛、指關節疼痛及/或頸關節疼痛、晨起關節僵硬、呼吸時胸痛(胸膜炎)、眼睛灼燒、眼睛搔癢及眼睛分泌物、皮膚下小結、手腳麻木、手腳刺痛或手腳發熱。
    在另一實施例中，根據本文所述之方法治療之疾病或病症為克隆氏症。在一特定實施例中，用於治療克隆氏症之方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。在另一特定實施例中，本文所述之用於預防或改善克隆氏症之一或多個症狀之方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。克隆氏症之症狀包括(但不限於)腹部(腹區域)痙攣疼痛、發燒、疲勞、食欲不振、排便疼痛(裡急後重)、頑固水性腹瀉、無意識體重下降、便秘、眼睛發炎、瘻管(通常在直腸區域周圍，可能導致排膿、黏液或大便)、關節疼痛、肝炎、口腔潰瘍、直腸出血及血便、皮膚腫塊或瘍(潰瘍)及牙齦腫脹。
    在另一實施例中，根據本文所述之方法治療之疾病或病症為僵直性脊椎炎。在一特定實施例中，用於治療僵直性脊椎炎之方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。在另一特定實施例中，用於改善或預防僵直性脊椎炎之一或多個症狀之方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。僵直性脊椎炎之症狀包括(但不限於)：下後背及臀部、背脊及/或頸部之頻繁疼痛與僵硬；以及蔓延至肋骨、肩胛骨、髖關節、大腿骨及腳後跟之疼痛與觸痛；導致發紅、眼睛疼痛、視力下降、飛蚊症及畏光症之眼睛發炎(虹膜睫狀體炎及葡萄膜炎)；疲勞；以及噁心。
    在另一實施例中，根據本文所述之方法治療之疾病或病症為糖尿病。在一特定實施例中，用於治療糖尿病之方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。在另一特定實施例中，用於改善或預防糖尿病之一或多個症狀之方法包含以下步驟：向有需要之個體投予治療有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。糖尿病之症狀包括(但不限於)體重下降、多尿症(頻繁排尿)、多渴症(口渴感增強)、多食症(饑餓感增強)、心血管疾病、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性神經病變、高滲透壓非酮性狀態及糖尿病酮酸症。
    在特定實施例中，向先前已接受或當前正接受一或多個其他療法之患者投予本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段。
    在特定實施例中，向先前已接受或當前正接受一或多個其他療法之患者投予本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段。在其他特定實施例中，向具有消炎療法抗性或難治性之患者或懷疑具有消炎療法抗性或難治性之患者投予本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段。
    在某些態樣中，本發明提供在有需要之個體中殺死T細胞的方法，其中該方法包含以下步驟：向該個體投予有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。在某些態樣中，本文提供誘導有需要之個體中之活化T細胞之細胞凋亡的方法，其中該方法包含以下步驟：向該個體投予有效量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段。
    在某些實施例中，可藉由任何合適方法向有需要之個體投予本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段或該抗體或抗體衍生抗原結合片段之醫藥組成物。投藥方法之非限制實例包括：靜脈內注射，皮下注射或植入，肌肉內遞送、脊髓內遞送、腹膜內遞送、直腸內遞送、陰道內遞送、鼻內遞送、胃內遞送、氣管內遞送或肺內遞送及/或本文所述或此項技術中已知之任何其他物理遞送方法。在一個實施例中，向有需要之個體全身性(例如非經腸)投予抗體或抗體衍生抗原結合片段或該抗體或抗體衍生抗原結合片段之醫藥組成物。在另一實施例中，向有需要之個體局部(例如瘤內)投予抗體或該抗體之醫藥組成物。各劑量可藉由或可不藉由相同投藥途徑投予。在一些實施例中，本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段與本文所述之其他劑量之相同或不同抗體經由多種投藥途徑同時或連續投予。
    當治療疾病或疾病之症狀時，投予抗體或抗體衍生抗原結合片段通常在疾病或疾病之症狀發作後進行。當預防疾病之症狀時，投予抗體或抗體衍生抗原結合片段通常在症狀發作前進行。
    投予本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段或該抗體或抗體衍生抗原結合片段之醫藥組成物的劑量及頻率係根據預防及/或治療同時使副作用最小化之方法投予。投予特定個體的本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段或該抗體或抗體衍生抗原結合片段之醫藥組成物之準確劑量可由行醫者根據與需要治療之個體有關之因素判定。可考慮之因素包括疾病病況之嚴重程度、個體之一般健康狀況、年齡、及個體之體重、飲食、投藥時間與頻率、與其他治療藥劑或藥物之組合、反應靈敏度及對療法之耐受度/反應。可隨著時間調整所述抗體或抗體衍生抗原結合片段或該抗體或抗體衍生抗原結合片段之醫藥組成物的投予劑量與頻率，以提供足夠的抗體或抗體衍生抗原結合片段含量或維持所要效果。
    用於調配物中之精確劑量亦將取決於投藥途徑及發炎性病症或疾病之嚴重性，且該精確劑量應根據行醫者之判斷及每一患者之情況決定。
    可根據自活體外或動物模型測試系統獲得之劑量反應曲線推測有效劑量。
    在一個實施例中，為預防及/或治療本文所述之疾病或病症而投予患者之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段的劑量通常為每公斤患者體重0.001 mg至100 mg。在另一實施例中，在治療上有效預防及/或治療本文所述之疾病或病症的抗體或抗體衍生抗原結合片段之合適劑量範圍為每公斤患者體重0.01 mg至100 mg。
    在特定實施例中，本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段之「有效量」係指本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段足以達成以下效果中之至少一者、至少兩者、至少三者、至少四者或四者以上的量：(i)減輕或改善本文所述之疾病或病症及/或與該疾病或病症相關之一或多個症狀之嚴重程度；(ii)減少與本文所述之病症或疾病相關之一或多個症狀之持續時間；(iii)預防疾病或病症之復發；(iv)疾病或病症或與該疾病或病症相關之一或多個症狀消退；(v)減少個體住院；(vi)減少住院期長度；(vii)個體之存活增加；(viii)抑制疾病或病症及/或與該疾病或病症相關之一或多個症狀之進展；(ix)增強或改善另一療法之治療效果；(x)減輕或消除疾病或病症；(xi)減少死亡率；(xii)降低住院率；(xiii)預防與疾病或病症相關之一或多個症狀之發展或發作；及(xiv)生活品質改善，如藉由此項技術中熟知之方法(例如問卷調查)評估。在一些實施例中，如本文中所用之「有效量」係指本發明所述之抗體達成以下第6部分中所述之特定效果的量。在某些實施例中，抗體或抗體衍生抗原結合片段之有效量為約0.01 mg至約1000 mg。
    在一些實施例中，單一劑量之本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段向患者投予一或多次以預防及/或治療本文所述之病症或疾病。
    在特定實施例中，根據預防及/或治療本文所呈現之病症或疾病之方法周期地向個體投予抗體或抗體衍生抗原結合片段或該抗體或抗體衍生抗原結合片段之醫藥組成物，其中抗體或抗體衍生抗原結合片段或醫藥組成物投予一段時間，接著為停藥期(亦即，不投予抗體或抗體衍生抗原結合片段或醫藥組成物的時期)。
    本發明所提供之抗體或抗體衍生抗原結合片段可在用於預防及/或治療本文所述之病症或疾病的一或多種其他療法(例如藥劑)投予之前、同時或之後投予。使用術語「組合」不限制向個體投予抗體或抗體衍生抗原結合片段及一或多種其他療法之順序。在特定實施例中，可連續或依序投予療法。
    在另一特定實施例中，本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段與一定量之另一療法(諸如消炎藥劑)組合使用以預防及/或治療本文所述之疾病或病症。在一特定實施例中，此組合療法具有協同效果。在其他實施例中，此組合具有相加效果。
    在一特定實施例中，抗體或抗體衍生抗原結合片段及其他療法允許使用較低劑量(例如次佳劑量)之抗體或抗體衍生抗原結合片段及/或額外療法且/或允許較低頻率地向個體投予本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段或其他療法。在某些實施例中，能夠利用較低劑量的本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段及/或其他療法及/或能夠較低頻率地投予抗體或抗體衍生抗原結合片段或該其他療法可減少與投予患者抗體或抗體衍生抗原結合片段或該其他療法分別相關的毒性，而不會降低抗體或該其他療法分別預防及/或治療本文所述病症或疾病的功效。在一些實施例中，本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段與其他療法組合投予可提高本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段及/或該其他療法預防及/或治療本文所述病症或疾病的功效。在一些實施例中，投予本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段及一或多種其他療法可避免或減少與使用任何單一療法相關的不利或有害副作用。
    在一特定實施例中，本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段所投予之個體為動物(例如獼猴或人類個體)。在一較佳實施例中，本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段所投予之個體為人類。在一特定實施例中，抗體或抗體衍生抗原結合片段所投予之個體呈現本文所述之疾病或病症之一或多個症狀。
    6.6基於細胞之方法
    本發明提供誘導或增強表現PSGL-1之細胞之細胞凋亡的方法，該方法包含以下步驟：使細胞與有效量之本發明所述抗體接觸。在一個實施例中，該細胞為免疫細胞。在特定實施例中，該細胞為T細胞。在一更特定實施例中，該細胞為活化T細胞。用於偵測細胞凋亡之方法描述於此項技術中且可由熟習此項技術者容易地實施。在特定實施例中，誘導或增強表現PSGL-1之活化T細胞之細胞凋亡的方法包含以下步驟：使細胞與有效量之本發明所述抗體接觸，其中有效量為足以誘導或增強細胞凋亡的量，如藉由熟習此項技術者已知之方法評估。
    本發明提供減少或抑制表現PSGL-1之細胞之存活的方法，該方法包含以下步驟：使細胞與有效量之本發明所述抗體接觸。在一個實施例中，該細胞為免疫細胞。在一特定實施例中，該細胞為T細胞。在一更特定實施例中，該細胞為活化T細胞。細胞存活分析描述於此項技術中且可由熟習此項技術者容易地實施。舉例而言，細胞存活率可藉由使用錐蟲藍染色或此項技術中已知的其他細胞死亡標記(例如磷脂結合蛋白-5染色)或存活率標記(例如碘化丙錠或7-AAD排除法)。在特定實施例中，減少或抑制表現PSGL-1之活性T細胞之方法包含以下步驟：使細胞與有效量之本發明所述抗體接觸，其中有效量降低或抑制細胞之存活，如藉由熟習此項技術者已知之方法(例如錐蟲藍排除分析或碘化丙錠或7-AAD排除法)評估。
    6.7套組
    本發明提供包含一或多個容器之醫藥包或套組，該一或多個容器填充有本發明所述之醫藥組成物之一或多種成分，諸如本發明所提供之抗體或抗體衍生抗原結合片段。此(等)容器視情況可附有通知書，該通知書形式由管制醫藥產品或生物產品之製造、使用或銷售的政府機構規定，該通知書反映政府機構已批準製造、使用或銷售以便投予人類。
    在一特定實施例中，本發明提供包含第一容器之套組，該第一容器含有本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段。在一特定實施例中，套組包含第一容器，該第一容器為小瓶，該小瓶含有在真空下呈凍乾無菌粉末形式之該抗體或該抗體衍生抗原結合片段，且該套組進一步包含第二容器，該第二容器包含藥學上可接受之流體。
    在一特定實施例中，本發明提供含有本發明所述抗體或抗體衍生抗原結合片段之注射裝置。在一特定實施例中，注射裝置之無菌溶液中抗體。在一特定實施例中，本發明提供之注射裝置為注射器。
    本發明亦提供可用於上述方法中之套組。在一個實施例中，套組在一或多個容器中包含本發明所述之抗體或抗體衍生抗原結合片段，較佳為純化抗體。在一特定實施例中，本發明所述之套組含有實質上分離的PSGL-1作為對照物。在另一特定實施例中，本發明所述之套組進一步包含不與PSGL-1反應之對照抗體。在另一特定實施例中，本發明所述之套組含有用於偵測抗體或抗體衍生抗原片段結合至PSGL-1(例如抗體或抗體衍生抗原結合片段可結合至可偵測受質，諸如螢光化合物、酶受質、放射性化合物或發光化合物，或識別第一抗體或抗體衍生抗原結合片段之第二抗體可結合至可偵測受質)之一或多種成份。在特定實施例中，套組可包括重組產生或化學合成之PSGL-1。套組中所提供之PSGL-1亦可附著至固體支撐物。在一更特定實施例中，上述套組之偵測構件包括PSGL-1所附著之固體支撐物。此套組亦可包括經報導體標記之非附著抗人抗體。在此實施例中，抗體或抗體衍生抗原結合片段結合至PSGL-1可藉由該經報導體標記之抗體之結合來偵測。
    7.實例
    此部分(亦即第6部分)中之實例是為了說明(而非為了限制)而提供。
    7.1實例1：產生抗PSGL-1單株抗體
    抗體h15A7含有2005年11月24日公開之國際申請公開案第WO 2005/110475號中所述之人類化15A7重鏈及輕鏈可變區，該案以全文引用之方式併入本文中。抗體h15A7為具有κ型輕鏈之IgG4同型抗體。使用突變引子、藉由PCR將Ser228→Pro228突變引入h15A7之鉸鏈區。h15A7之所得鉸鏈突變體在本文中稱為15A7H。15A7H之剩餘蛋白質序列與h15A7相同。15A7H之胺基酸序列顯示於第7A圖至第7B圖中且描繪於SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2中。重鏈及輕鏈之抗體編碼基因序列引入衍生自載體pAD-CMV1(描述於EP 393 438中)之真核表現載體中。
    使用此項技術中已知之方法產生15A7H。簡而言之，將重組表現載體共轉染至懸浮適應之CHO-DG44宿主細胞中，該等重組表現載體除了編碼15A7H之重鏈及輕鏈以外，亦分別編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)及新黴素磷酸轉移酶選擇標記。在不含次黃嘌呤/胸腺嘧啶核苷之選擇性培養基中轉染及添加抗生素G418後第2天，選擇經穩定轉染之細胞。一旦利用初始選擇回收細胞，則藉由添加胺甲葉酸來誘導基於DHFR之基因增幅。藉由單一細胞沉積，使用CHO-DG44宿主細胞開發15A7H之單株生產細胞株。為了產生15A7H抗體，擴增細胞用作生產性生物反應器之接種體。生產性生物反應器以分批追加模式運行8天至14天。為有助於產生抗體且為了延長細胞培養生產週期，在生產階段期間添加營養飼料培養基。藉由離心及有效移除細胞的死端式過濾來收穫細胞培養液，從而為產物之進一步純化提供無細胞培養液(CCF)。在收穫期間移除細胞後，經由蛋白質A親和層析法及陰離子與陽離子交換層析法純化蛋白質。此外，包括兩個有力的病毒清除步驟：低pH病毒去活步驟及移除病毒之奈米過濾步驟。
    15A7H之純度由毛細管凝膠電泳方法測定。使用SDS(十二烷基磺酸鈉)使樣品變性且在填充凝膠緩衝劑之毛細管中基於尺寸分離樣品，該凝膠緩衝劑用作篩分介質。在經還原樣品中，用2-巰基乙醇還原雙硫鍵，從而使抗體之重鏈及輕鏈之峰分離。在未經還原之樣品中，添加碘乙醯胺(烷化劑)以避免樣品製劑所誘發之任何碎斷且確保主IgG峰維持完整。
    電動注射樣品且使用UV偵測器、藉由200 nm之UV吸光度偵測流動蛋白質。對於經還原樣品而言，報導重鏈與輕鏈總和(% LC+HC)之時間校正面積百分比(TCA%)。未經還原之樣品之可報導值為IgG主峰之TCA%。
    藉由非還原毛細管凝膠電泳(CGE)(圖1)偵測較低量之半抗體分子，非還原毛細管凝膠電泳指示Ser228→Pro228突變顯著降低鉸鏈區中之鏈內雙硫鍵形成。半抗體分子之量自h15A7之約8-10%減低至15A7H之1%以下。
    15A7H之配方展示於表6中。
    7.2實例2：15A7H抗體對活化初級人類T細胞之結合
    檢驗15A7H對初級活化人類CD4+ T細胞之結合。
    7.2.1.材料及方法
    細胞培養及T細胞活化。1x106個週邊血CD4+ T細胞在37℃下於RPMI完全培養基中培養且用所添加的20 μg/ml PHA-L(Sigma，目錄號L2769)刺激2天。細胞在37℃下用20 ng/ml IL-2(R&D systems，目錄號RD202-IL)再培養四至五天以產生「活化CD4+ T細胞」。
    細胞結合分析：對活化人類CD4+ T細胞計數且於FACS緩衝液中以1x105個細胞/100 μl接種於V型底96孔培養盤(Falcon BD，目錄號353263)中，且在冰上培養30分鐘。
    抗溶菌酶IgG4同型對照物，h15A7及15A7H皆於圓底稀釋盤(Falcon，目錄號353077)中之FACS緩衝液中稀釋至90 μg/ml。在整個稀釋盤上，對各種抗體之抗體製劑進行十一次3倍連續稀釋，其中起始濃度為30 μg/ml。
    將雙重複細胞樣品離心且再懸浮於最初起始濃度為30 μg/ml之100 μl各抗體稀釋液中。細胞在冰上培養60分鐘。將細胞離心為小片且使用洗滌緩衝液洗滌，接著添加100 μl經稀釋之二次山羊F(ab)2抗人類Ig's R-PE共軛抗體。二次山羊F(ab)2抗人類Ig's R-PE共軛抗體(BD Biosciences，目錄號554655；以1.05 mg/ml儲備)預先於FACS緩衝液中按1：800稀釋。細胞在黑暗中於冰上培養30分鐘，隨後離心為小片且用洗滌緩衝液洗滌兩次。將細胞再懸浮於150 μl洗滌緩衝液中且藉由添加50 μl之BD cytofix/Cytoperm(BD Biosciences，目錄號554655)固定緩衝劑固定。
    在BD FACS Array生物分析儀上分析樣品。根據SSC及FSC及針對各種樣品測定之平均螢光，依據「淋巴球」閘設定，使用BD FACS Array流式細胞儀獲取每個細胞樣品約5000個事件。
    資料分析：藉由使用XLfit(模式：單位點劑量反應，205)對各雙重複樣品之抗體濃度與平均螢光指數(MFI)作圖來測定抗溶菌酶IgG4、h15A7及15A7H抗體對活化CD4+ T細胞之結合親和力。根據各結合曲線確定EC50值。
    7.2.2.結果：
    結合至活化人類T細胞：使用流動式細胞測量術測定15A7H結合至活化人類CD4+ T細胞。圖2展示15A7H以0.22 nM之EC50結合。
    來自多位供者之結合資料集展示15A7H以0.22+/-0.02之平均EC50結合至活化CD4+ T細胞。使用來自4位供者之EC50值計算平均值+/-SEM。在相同條件下測試抗體h15A7且抗體h15A7以0.27+/-0.05之平均EC50結合至活化CD4+ T細胞。因此，15A7H及h15A7與活化T細胞之結合相當(參見表7)。
    7.3實例3：15A7H在人類轉移體內遲發型過敏反應小鼠模型中之活體內活性
    在轉移體內遲發型過敏反應(DTH)雌性C57BL/6小鼠模型中測試15A7H。腹膜內給予0.03 mg/kg、0.10 mg/kg、0.3 mg/kg、1 mg/kg及10 mg/kg劑量之含於調配緩衝液中的15A7H。在相同條件下測試抗體h15A7。
    7.3.1.材料及方法
    轉移體內分析：6至8周齡雌性C57BL/6小鼠購自Harlan Sprague Dawley,Inc.(Indianapolis,Indiana)且於送達後四周內使用。所有小鼠皆圈養於無病原體環境中且根據NIH準則處理。所有動物實驗皆由實驗動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee；IACUC)評估及核準，且所有動物實驗遵照NIH準則(「牽涉動物與人類之研究指導準則(Guiding Principles for Research Involving Animals and Human Beings)」)執行。
    藉由靜脈穿刺自正常人類供者收集血液，該等正常人類供者已知為良好破傷風反應者。將一百毫升全血吸入CPT真空採血管(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)中且以1800 RCF離心30分鐘。將含有單核細胞及血小板之淡黃色層分離、洗滌三次且再懸浮於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中且計數。藉由於PBS中多次洗滌最小化血小板污染。允許血小板與PBMC之比率不超過1：1。立即將細胞注射至小鼠足蹠(footpad)中。
    磷酸鋁所吸附之破傷風類毒素(TT-Tetguard)以每個注射部位0.25 Lf之濃度使用(Lf單位為絮聚值，即在與一個國際單位之抗毒素混合時產生最佳絮凝混合物之類毒素之量)。
    將0.25 Lf單位之TT與7-10×106 PBMC的混合物(總體積為50 μl)注射至小鼠之後足蹠中。在注射前及注射後24小時使用針盤式厚度規(Mitutoyo,Aurora,IL)量測足蹠厚度。自注射後24小時之厚度減去注射前厚度以獲得爪厚度之變化。所有度量單位均為英吋。
    測試15A7H及h15A7：將15A7H及h15A7(以10 mg/ml儲備)溶解於含有25 mM檸檬酸鈉及115 mM氯化鈉以及0.04% Tween 80的媒介物(pH為5.97)中。在用含或不含TT之PBMC注射足蹠前一個小時，用0.2 ml媒介物或0.03 mg/kg、0.1 mg/kg、0.3 mg/kg、1 mg/kg及10 mg/kg之15A7H或h15A7對小鼠進行腹膜內注射。針對四位不同供者之PBMC測試各劑量之15A7H抗體及h15A7抗體，且每位供者每次處理使用一個小鼠。對15A7H及h15A7處理組與媒介物處理組進行比較。
    統計資料：除非另有特定說明，否則所有值皆以平均值±SEM報導。對藥物處理組與媒介物處理組的足蹠厚度變化進行比較。合併來自四個個別供者實驗之△爪厚度且計算平均值±SEM。如下計算爪厚度之抑制百分比：100×(△爪厚度veh-△爪厚度drug)/(△爪厚度veh-△爪厚度PBMC)。使用克-瓦二氏單因子等級變異數分析(Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance(ANOVA)on Ranks)檢驗抑制效果之顯著性。p值小於0.05視為具有統計顯著性。
    C57BL/6小鼠血漿中之15A7H及h15A7含量：測定0.03 mg/kg、0.1 mg/kg、0.3 mg/kg、1 mg/kg及10 mg/kg之15A7H及h15A7在腹膜內注射至雌性C57BL/6小鼠中之後24小時的血漿含量。在實驗終止時自轉移體內DTH實驗動物收集血漿樣品。對所有樣品執行生物分析。
    對15A7H之伴隨藥物動力學研究：利用接受15A7H之腹膜內劑量(與上述劑量相同)的衛星雌性C57BL/6小鼠(satellite female C57BL/6 mice)來收集資料，該等資料更集中於15A7H血漿濃度。此等小鼠不用人類PBMC或破傷風類毒素處理。此等「PK」小鼠之取樣時間為給藥後1小時、3小時、5小時及24小時。PK小鼠之各劑量組由6個小鼠組成。在各劑量組內，3個小鼠之小組用於在1小時及5小時時取樣，且3個小鼠的另一小組用於在3小時及24小時時取樣。
    對h15A7及15A7H之生物分析：使用三明治ELISA法定量小鼠血漿中之h15A7或15A7H濃度。簡而言之，使用塗有PSGL-1之96孔微量滴定盤結合經稀釋血漿樣品中之h15A7或15A7H。洗滌後，藉由生物素標記單株抗人類IgG4抗體及酶(HRP)標記抗卵白素偵測所結合之h15A7或15A7H。在受質反應期間形成著色產物之量以光測定法量測且隨著樣品中h15A7或15A7H之濃度增大而增加。經由對非線性標準曲線進行數據擬合來計算對應於所測吸光度的h15A7或15A7H濃度。校正樣品之範圍為自0.04 ng/mL至1.2 ng/mL。按至少1：100稀釋樣品。因此，全血漿中之h15A7或15A7H之定量下限為4 ng/mL。藉由使用較高稀釋因數，可將定量上限增加至達2.4 mg/mL(1：2000000)。
    由於在ELISA中，h15A7與15A7H參考物質之反應性差異微小，因此使用兩個校正曲線及兩組品質控制參數。相對h15A7校正曲線分析經h15A7處理之動物樣品，且相對15A7H校正曲線分析經15A7H處理之動物樣品。
    7.3.2.結果
    轉移體內DTH：圖3顯示在轉移體內DTH中15A7H抗體對4位供者之PBMC的合併劑量反應，如15A7H處理後之DTH之抑制百分比所示。當在-1小時腹膜內給予小鼠0.03 mg/kg、0.1 mg/kg、0.3 mg/kg、1 mg/kg及10 mg/kg之h15A7及15A7H時，h15A7與15A7H均以劑量依賴方式抑制轉移體內DTH。表8展示轉移體內DTH中之15A7H及h15A7之劑量反應與抑制百分比。0.3 mg/kg或高於0.3 mg/kg之單一劑量15A7H或h15A7展示轉移體內DTH受到顯著抑制。此分析中h15A7及15A7H之ED50分別為0.09 mg/kg及0.1 mg/kg，n=4位供體。

    化合物血漿濃度：衛星PK小鼠與DTH小鼠兩者之15A7H之血漿濃度概述於圖5中。圖4顯示相對於DTH之抑制百分比所繪出的15A7H之24小時合併血漿濃度。注意，以指定劑量給予PK小鼠及DTH小鼠後24小時時的平均濃度十分相似。此情況表明，儘管對PK小鼠及DTH小鼠的處理不同(僅DTH小鼠接受PBMC及破傷風類毒素)，但兩種情況下之15A7H藥物動力學十分相似。h15A7與15A7H兩者在研究期間之血漿濃度(在給藥後1小時至24小時之間量測濃度)僅在很窄範圍內波動。
    PK-PD：表9及表10顯示h15A7及15A7H抗體之二十四小時血漿濃度(PK)及相同劑量下之轉移體內DTH(PD)之相應抑制百分比。圖4對比轉移體內DTH模型中之15A7H之PK-PD關係。h15A7及15A7H之ED50經計算分別為687 ng/ml及770 ng/ml，n=4位供者。

    7.3.3.結論
    0.3 mg/kg或高於0.3 mg/kg之單一劑量15A7H或h15A7展示轉移體內DTH之顯著抑制百分比。轉移體內DTH分析中之h15A7及15A7H之ED50分別為0.09 mg/kg及0.1 mg/kg。h15A7與15A7H兩者之血漿濃度在研究期間僅在很窄範圍內波動。
    7.4實例4：評估補體依賴細胞毒性(CDC)
    為了判定15A7H是否具有CDC活性，使用乳酸鹽脫氫酶釋放分析量測不同濃度下之CDC活性。
    7.4.1.材料及方法
    Ramos細胞(自ATCC獲得；目錄號CRL-1596)用作目標細胞且於具有0.5 mg/ml遺傳黴素(Geneticin)(Invitrogen,Carlsbad,CA；目錄號10131)之完全DMEM培養基(Invitrogen,Carlsbad,CA；目錄號11995)中培養。兔子補體用作補體蛋白來源(Accurate Chemical &Scientific Corp.,Westbury,NY；目錄號：AIC4000-1)。Cedarlane細胞毒性培養基用作分析培養基(Accurate Chemical &Scientific Corp.,Westbury,NY；目錄號：CL95100)。
    使用細胞毒性偵測套組+(Cytotoxicity Detection KitPLUS)(LDH)(Roche Applied Science,Indianapolis,IN；目錄號：04 744 934 001)藉由目標細胞之LDH釋放來測定CDC活性。自1F5融合瘤(ATCC)純化之小鼠抗人類CD20(Birmingham,AL；目錄號：6140-01)用以活化在分析中作為陽性對照抗體之補體。人類IgG4κ(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO；目錄號：I4639)用作同型對照物。如下設立樣品及對照物(所有樣品皆具有雙重複)：
    。樣品：100 μl標準兔補體(於分析培養基中按1：6稀釋)+50 μl目標細胞(Ramos細胞，存於分析培養基中)+50 μl抗體稀釋物
    。背景對照物：200 μl分析培養基
    。最大釋放對照物：50 μl目標細胞+100 μl標準兔補體+50 μl分析培養基
    。自發性釋放對照物：50 μl目標細胞+100 μl標準兔補體+50 μl分析培養基
    將培養盤在濕潤CO2培養箱中於37℃下培養3小時。在培養結束前30分鐘(在2.5小時培養後)，將10 μl溶胞溶液(提供於細胞毒性偵測套組中)添加至最大釋放對照樣品中。在培養結束時，在室溫下將培養盤以200 g離心10分鐘，且將100 μl之無細胞上清液轉移至96孔平底盤之相應孔中用於LDH偵測。將100 μl反應混合物(提供於細胞毒性偵測套組中)添加至各孔中，且在室溫下於黑暗中將盤培養15分鐘至30分鐘。在第二次培養結束時，藉由添加50 μl中止溶液(提供於細胞毒性偵測套組中)中止反應。在SpectraMAX Plus讀盤器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)上以490 nm至492 nm波長量測吸光度。使用([抗體誘導釋放]-[自發性釋放對照物])/([最大釋放])-([自發性釋放對照物])×100%來計算CDC%。
    7.4.2.結果
    使用Ramos細胞、在針對抗CD20之CDC反應最佳化的條件下測試15A7H之CDC活性。如圖6及表11所示，測試1：12固定補體稀釋之不同濃度抗體的CDC活性。未偵測到15A7H、h15A7或IgG4陰性對照物的CDC活性。小鼠抗人類CD20展示明顯的抗體劑量反應。
    7.4.3.結論
    在對Ramos細胞執行之分析中，直至抗體濃度按1：12補體稀釋度達到5 μg/ml，15A7H皆未顯示CDC活性。
    7.5實例5：臨床研究
    藉由靜脈內投予125 μg/kg、500 μg/kg、1000 μg/kg及2000 μg/kg單一漸增劑量給予個體15A7H，且藉由皮下投予500 μg/kg及1000 μg/kg單一劑量給予其他個體15A7H。修改劑量。使用表6所述調配物中再懸浮的15A7H。投藥後，使用此項技術中已知之方法執行臨床實驗室測試(例如血液學、臨床化學及尿分析)，例如每週執行一次。亦使用此項技術中已知之方法測定藥物動力學參數，例如每週測定一次。
    此申請案中所述之所有公開案、專利案及專利申請案皆以全文引用之方式併入本文中，就如同每一個別公開案或專利申請案經特定地且個別地指示以引用方式併入一般。儘管為了清楚瞭解之目的已利用說明及實例詳細描述本發明，但熟習此項技術者根據此發明之教示將顯而易知，可在不脫離隨附申請專利範圍之精神或範疇的情況下對本發明進行某些變更及修改。
    圖1描繪h15A7及15A7H之非還原性毛細管凝膠電泳(CGE)。箭頭指示半個抗體分子之峰值。
    圖2描繪15A7H抗體及對照抗體結合至活化人類CD4+ T-細胞。使用單位點四參數擬合模型(one site 4-parameter fit model)、藉由對平均螢光強度(MFI)相對於抗體濃度作圖來得出EC50值(nM)。
    圖3描繪在轉移體內遲發型過敏反應(trans-vivo DTH)中15A7H抗體對4位供體之週邊血單核細胞(PBMC)之合併劑量反應。用0.03 mg/kg、0.1 mg/kg、0.3 mg/kg、1 mg/kg及10 mg/kg抗體或媒介物處理後，4位供體之合併平均值±SEM。pbmc：僅PBMC，V：媒介物，0.03 mg/kg、0.1 mg/kg、0.3 mg/kg、1 mg/kg及10 mg/kg之15A7H抗體。回應於0.03 mg/kg、0.1 mg/kg、0.3 mg/kg、1 mg/kg及10 mg/kg之15A7H抗體處理，足蹠厚度之抑制百分比。
    圖4描繪在單次腹膜內注射後，15A7H抗體在C57BL/6小鼠中之二十四小時血漿濃度。相對於兩種抗體在轉移體內DTH分析中對足蹠厚度之抑制百分比，對該兩種抗體在實驗動物中之合併血漿含量(平均值±SEM，n=4)作圖。
    圖5描繪15A7H在C57BL/6小鼠中之血漿濃度與時間的關係。四隻衛星小鼠腹膜內給予0.03 mg/kg、0.1 mg/kg、0.3 mg/kg、1 mg/kg及10 mg/kg之15A7H抗體。在1小時、3小時、5小時及24小時時收集血樣。
    圖6描繪15A7H抗體及對照抗體之CDC活性，該等抗體之CDC活性在不同濃度(5 μg/ml、0.5 μg/ml、0.05 μg/ml、0.005 μg/ml及0.0005 μg/ml)下測試。
    圖7A描繪抗體15A7H之重鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：2)。重鏈可變區(SEQ ID NO：4)為粗體。CDRs(CDR1(SEQ ID NO：8)、CDR2(SEQ ID NO：9)及CDR3(SEQ ID NO：10))加框顯示。亦顯示構架區(FR1(SEQ ID NO：17)、FR2(SEQ ID NO：18)、FR3(SEQ ID NO：19)及FR4(SEQ ID NO：20))。顯示恆定區。鉸鏈區胺基酸序列(SEQ ID NO：12)加框顯示。鉸鏈區胺基酸位置228處之經取代脯胺酸用斜體表示。
    圖7B描繪抗體15A7H之輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：1)。輕鏈可變區(SEQ ID NO：3)為粗體。CDRs(CDR1(SEQ ID NO：5)、CDR2(SEQ ID NO：6)及CDR3(SEQ ID NO：7))加框顯示。亦顯示構架區(FR1(SEQ ID NO：13)、FR2(SEQ ID NO：14)、FR3(SEQ ID NO：15)及FR4(SEQ ID NO：16))。顯示恆定區。
    <110> 荷蘭商、台醫生物科技股份有限公司(AbGenomics Cooperatief U.A.) 巴莎拉柏史蒂芬(BASSARAB,Stefan) 安安可爾芭芭拉(ENENKEL,Barbara) 加里德爾派翠克(GARIDEL,Patrick) 舒特海壯(SCHOTT,Heidrun) 辛珊加雅(SINGH,Sanjaya) 利特珊博格托比雅斯(LITZENBURGER,Tobias)
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    <213> 人工序列
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    <223> IgG4鉸鏈區胺基酸序列
    <400> 12
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    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 15A7H VL FR1
    <400> 13
    <210> 14
    <211> 15
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 15A7H VL FR2
    <400> 14
    <210> 15
    <211> 32
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 15A7H VL FR3
    <400> 15
    <210> 16
    <211> 11
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 15A7H VL FR4
    <400> 16
    <210> 17
    <211> 30
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 15A7H VH FR1
    <400> 17
    <210> 18
    <211> 14
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 15A7H VH FR2
    <400> 18
    <210> 19
    <211> 32
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 15A7H VH FR3
    <400> 19
    <210> 20
    <211> 11
    <212> PRT
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 15A7H VH FR4
    <400> 20
    <210> 21
    <211> 13
    <212> PRT
    <213> 人類
    <220>
    <223> IgG4野生型鉸鏈區胺基酸序列
    <400> 21
    权利要求:
    Claims (16)
    [1] 一種免疫特異性結合至人類PSGL-1之單株抗體，該單株抗體包含：(i)一輕鏈可變(「VL」)區，包含胺基酸序列SEQ ID NO：3；(ii)一重鏈，包含重鏈可變(「VH」)區，該重鏈可變區包含胺基酸序列SEQ ID NO：4；及(iii)一人類IgG4恆定區，該人類IgG4恆定區在根據EU索引編號之該重鏈之胺基酸228處含有絲胺酸變成脯胺酸的取代。
    [2] 一種免疫特異性結合至人類PSGL-1之單株抗體，該單株抗體包含：(i)一輕鏈，包含胺基酸序列SEQ ID NO；1；及(ii)一重鏈，包含胺基酸序列SEQ ID NO：2。
    [3] 一種免疫特異性結合至人類PSGL-1之單株抗體，該單株抗體包含：(i)一重鏈，由SEQ ID NO：2組成；及(ii)一輕鏈，由SEQ ID NO：1組成。
    [4] 一種免疫特異性結合至人類PSGL-1之單株抗體，該單株抗體包含一重鏈，該重鏈包含：(i)一VH鏈區，包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10；及(ii)一人類IgG4重鏈恆定區，該人類IgG4重鏈恆定區在根據該EU索引編號之該重鏈之胺基酸228處含有絲胺酸變成脯胺酸的胺基酸取代。
    [5] 如請求項4所述之單株抗體，其中該單株抗體進一步包含一輕鏈，該輕鏈包含含有SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7之一VL鏈區。
    [6] 如請求項1至5中任一項所述之單株抗體，其中該抗體經純化。
    [7] 一種醫藥組成物，包含如請求項1至6中任一項所述之單株抗體及一醫藥學上可接受之載劑。
    [8] 如請求項7所述之醫藥組成物，其中該單株抗體經純化。
    [9] 一種包含SEQ ID NO：2的抗體重鏈。
    [10] 一種套組，含有一第一容器，該第一容器含有如請求項1至6中任一項所述之單株抗體。
    [11] 一種注射裝置，含有如請求項1至6中任一項所述之單株抗體。
    [12] 如請求項11所述之注射裝置，其中該注射裝置為一注射器。
    [13] 一種治療一發炎性病症之方法，該方法包含以下步驟：向有需要之一個體投予治療有效量的如請求項1至6中任一項所述之單株抗體或如請求項8或請求項9所述之醫藥組成物。
    [14] 一種治療一發炎性病症之方法，該方法包含以下步驟：向有需要之一個體投予治療有效量之如請求項7或8所述之醫藥組成物。
    [15] 如請求項13或14所述之方法，其中該發炎性病症為一自體免疫疾病。
    [16] 如請求項13至15中任一項所述之方法，其中該發炎性病症為：牛皮癬、斑塊狀牛皮癬、慢性斑塊狀牛皮癬、點狀牛皮癬、反轉型牛皮癬、膿皰型牛皮癬、紅皮症型牛皮癬、牛皮癬性關節炎、類風濕性關節炎、克隆氏症(Crohn's disease)、僵直性脊椎炎或糖尿病。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
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    优先权:
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    US201161496249P| true| 2011-06-13|2011-06-13||
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